慢性電刺激對(duì)成肌分化的C2C12細(xì)胞肌型轉(zhuǎn)換的影響.pdf

1、[背景和目的]
　　 阻塞型睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)是呼吸科的常見病、多發(fā)病，其特點(diǎn)為睡眠期間反復(fù)發(fā)生上氣道阻塞并引起呼吸暫停。表現(xiàn)為口鼻腔氣流停止而胸腹呼吸動(dòng)作尚存在。是一種累及多系統(tǒng)并造成多器官損害的睡眠呼吸疾病。有人提出假說(shuō)，認(rèn)為OSAHS主要由于上呼吸道橫紋肌適應(yīng)性下降，在非清醒狀態(tài)下(如睡眠)不能保持呼吸道的開放。目前認(rèn)為舌根松

2、弛、肥厚或者舌體肥厚導(dǎo)致睡眠期間舌后墜是OSAHS的常見病因之一。頦舌肌是最重要的上氣道擴(kuò)張肌，其正常收縮使舌體前移，阻止咽腔縮小并對(duì)抗氣流阻力，維持氣道通暢。據(jù)臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)，頦舌肌功能異?？蓪?dǎo)致上氣道陷閉，并且是引發(fā)OSAHS的最主要原因之一，因此，改善頦舌肌功能是有效、合理治療OSAHS的關(guān)鍵所在。
　　 骨骼肌可塑性強(qiáng)，多種外界刺激可致其肌纖維構(gòu)成及其功能發(fā)生轉(zhuǎn)變已是不爭(zhēng)的事實(shí)，而模仿通常用來(lái)支配慢收縮肌的神經(jīng)沖動(dòng)方

3、式發(fā)展而來(lái)的慢性低頻電刺激(Chronic low frequency electrical stimulation，CLFS)就是有效手段之一，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在慢性電刺激后，低壓缺氧兔頦舌肌的肌球蛋白重鏈(myosin heavychain，MHC)“由快向慢”轉(zhuǎn)變(MHC由Ⅱ型向Ⅰ型轉(zhuǎn)變)，這種轉(zhuǎn)變?cè)诘皖l復(fù)合生理頻率的電刺激時(shí)變化趨勢(shì)非常顯著。我們進(jìn)一步的研究表明，CESLPF誘導(dǎo)慢性低壓缺氧兔頦舌肌肌球蛋白重鏈由MHCⅡb型向

4、MHCⅡa和MHCⅠ型轉(zhuǎn)變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+的攝取-釋放功能顯著增強(qiáng)，這種變化在超低頻復(fù)合生理頻率刺激組的變化更加顯著。目前變頻電刺激引起的骨骼肌的肌纖維類型轉(zhuǎn)變機(jī)制尚不明確。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶(CaMK)在骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)變通路中起重要作用，但慢性變頻電刺激所致MHC肌型轉(zhuǎn)換是否與此有關(guān)尚未見詳細(xì)報(bào)道。
　　 因此，本研究以小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞成肌分化為模型，研究C

5、aN在MHC類型重構(gòu)中的作用，探討慢性變頻電刺激應(yīng)用于臨床治療OSAHS的可能機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 一、建立C2C12細(xì)胞成肌分化模型
　　 1.成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞系在含10%胎牛血清的DMEM增殖培養(yǎng)液(growthmedium，GM)中擴(kuò)增培養(yǎng)；
　　 2.待C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，改用含2%馬血清的DMEM分化培養(yǎng)液(differentiation medium，D

6、M)誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2，飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
　　 二、C2C12肌球蛋白重鏈MHC各亞型肌纖維比例的鑒定
　　 C2C12肌細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，采用請(qǐng)PCR和Western-blot分別檢測(cè)C2C12細(xì)胞MHC亞型的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 三、體外低頻復(fù)合生理頻率模型的建立
　　 我們采用自制變頻電刺激儀建立體外低頻復(fù)合生理頻率模型，將經(jīng)馬血清誘導(dǎo)分化的C2C1

7、2成肌細(xì)胞分為3組，分別為分化對(duì)照組、KN93(6μMol)組和CsA(8μMol)組，電刺激的頻率采用(10+40Hz)進(jìn)行刺激，每天刺激1.5 h，共刺激2天。
　　 四、低頻及低頻復(fù)合生理頻率對(duì)C2C12 MHC亞型表達(dá)的影響
　　 1.采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse ranscription-polymerase chainreaction，RT-PCR)分析各組C2C12 MHC各亞型mRNA表達(dá)

8、的變化
　　 2.采用Western印跡法分析各組兔頦舌肌MHC各亞型蛋白表達(dá)的變化
　　 五、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的檢測(cè)
　　 對(duì)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的檢測(cè)采用比色法進(jìn)行。檢測(cè)方法按照CaN活性比色法定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.成肌細(xì)胞C2C12經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后出現(xiàn)肌管，細(xì)胞分化好，說(shuō)明我們建立的成肌分化模型成功。
　　 2.RT-PCR和Western-blot

9、檢測(cè)結(jié)果顯示：分化對(duì)照組MHCⅠ型和MHCⅡ型均有表達(dá)，KN93及CSA組MHCⅠ型明顯被抑制。
　　 3.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，低頻及低頻復(fù)合生理頻率電刺激后，10 Hz電刺激時(shí)，CsA組和KN93組細(xì)胞MHCⅠ的mRNA表達(dá)均有顯著降低(P<0.05)，以CsA組MHCⅠ的表達(dá)降低最為明顯；當(dāng)采用復(fù)合生理頻率刺激時(shí)，CsA和KN93對(duì)MHCⅠ表達(dá)的抑制作用被完全逆轉(zhuǎn)，與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)
　　

10、 4.Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示：抑制劑KN93和CsA處理后，MHCⅠ的表達(dá)顯著降低，MHCⅡb顯著增加；CsA組經(jīng)低頻復(fù)合生理頻率電刺激可以抑制MHCⅡb的表達(dá)，但對(duì)MHCⅠ的提升不明顯，該結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 5.CsA可以顯著抑制CaN的酶活性。在C2C12細(xì)胞經(jīng)復(fù)合生理頻率刺激后，CaN的活性有所提高，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 [全文結(jié)論]
　　 1.成肌細(xì)胞C2C

11、12可以分化成肌管，是體外研究骨骼肌成肌細(xì)胞增殖、分化和功能理想的研究模型；
　　 2.KN93及CsA兩種抑制劑可以抑制MHCⅠ型的表達(dá)，這種現(xiàn)象對(duì)以后研究成肌細(xì)胞的分化及轉(zhuǎn)型是有幫助的；
　　 3.低頻復(fù)合生理頻率電刺激可以逆轉(zhuǎn)CsA及KN93對(duì)MHCⅠ型的抑制作用。這種變化可能緣于慢性電刺激所致的肌纖維類型轉(zhuǎn)變及其相應(yīng)MHC亞型合成改變；
　　 4.低頻復(fù)合生理頻率電刺激能夠部分逆轉(zhuǎn)CsA抑制CaN活性之后