新生兒黃疸的預測、干預治療措施研究.pdf

1、目的： 嚴重高膽紅素血癥可以導致膽紅素腦損傷甚至核黃疸。為了減少嚴重高膽紅素血癥及膽紅素腦損傷甚至核黃疸的發(fā)生，本課題從臨床、實驗方面進行了研究，分為三個階段進行。①尋找一種簡單易行的臨床指標，預測新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生。故通過測定早產(chǎn)兒及足月兒臍血甲胎蛋白值，探討臍血甲胎蛋白水平與新生兒黃疸發(fā)生是否存在相關性。同時需要了解生后血清甲胎蛋白與膽紅素水平的相關性。②UGT1A1的活性與血清膽紅素水平密切相關，因此研究大鼠肝臟發(fā)育

2、不成熟期其葡萄糖醛酸轉移酶1A1活性的發(fā)育規(guī)律，為如何預防及基因治療新生兒高膽紅素血癥提供實驗依據(jù)。③基因治療新生兒高膽紅素血癥能較長時間維持低血清膽紅素水平，因此是非常有前景的治療方案。首先獲得表達尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT1A1)基因；構建UGT1A1重組腺相關病毒載體，為應用UGT1A1重組腺相關病毒載體糾正UGT1A1基因缺陷所致UGT1A1減少或缺失而發(fā)生的高膽紅素血癥做前期準備。 方法： 1、檢測早產(chǎn)兒及

3、足月兒臍血AFP和血清膽紅素。 (1)取38例早產(chǎn)兒(其中胎齡在32周～33周8例，34周～35周13例，36周～＜37周的17例)臍血標本各2ml測定AFP值，所有早產(chǎn)兒在生后3天(57±10h)測定血清總膽紅素水平。 (2)取120例足月兒臍血測定AFP值，并測定生后3天的總膽紅素值，再隨機抽取其中發(fā)生高膽紅素血癥的患兒25例為實驗組，以未發(fā)生高膽紅素血癥的新生兒30例作為對照組測定生后1月內血清AFP值。

4、繪制散點圖，求直線回歸方程。 2、用Matern方法放射測定不同孕齡(孕17天～19天各5只)及出生后不同日齡(生后1～5天各10只，生后2周的5只)大鼠的肝臟葡萄糖醛酸轉移酶1A1活性，并制作放射自顯影圖。 3、設計、合成引物，通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)從HepG2細胞總RNA中擴增UGT1A1基因，構建UGT1A1基因克隆載體，陽性重組子篩選和測序。UGT1A1最終連接于pAAV-MCS，雙酶切、PCR鑒

5、定陽性重組質粒。pAAV-UGT1A1、pAAV-RC、pHelper同時轉移入HEK293T細胞，光鏡下觀察轉染后細胞的形態(tài)變化，熒光顯微鏡下記數(shù)發(fā)綠色熒光的細胞，間接了解轉染的效率，并測定重組腺相關病毒的滴度。 結果： 1、早產(chǎn)兒組臍血AFP值與生后3天的總膽紅素值呈線性相關。足月兒組臍血AFP值與生后3天的總膽紅素值呈線性相關。生后1月內血清AFP值實驗組與對照組存在顯著性差異(P＜0.01)。 2、大鼠肝

6、臟在孕17天～19天UGT1A1活性較低，而且增長幅度小，孕19天UGT1A1活性占成熟鼠活性的6.7％。生后1～2天時增長幅度很大，生后5天基本達成熟鼠水平，占成熟鼠活性的88.1％。將孕17天、孕19天、生后1天、成熟鼠這4組UGT1A1活性進行統(tǒng)計學檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義。從放射自顯影圖可以更加明確此規(guī)律。 3、成功擴增了人類UGT1A1基因，篩選出UGT1A1基因陽性克隆載體。UGT1A1連接于pAAV-MCS，構建表

7、達UGT1A1基因重組腺相關病毒載體，并成功表達于HEK293T細胞。轉染了UGT1A1基因重組腺相關病毒載體的細胞光鏡下出現(xiàn)皺縮、脫落，熒光顯微鏡下可見多個細胞顯示很強的綠色熒光，提示轉染效率較高，可達70％以上。經(jīng)計算病毒滴度為105.6PFU/ml。 結論： 1、新生兒甲胎蛋白值可作為肝臟發(fā)育成熟度的標志，為臨床預測高膽紅素血癥發(fā)生提供了另一指標。臍血甲胎蛋白值的范圍對預測膽紅素水平也有關。此項測定可以對嚴重的高膽

8、紅素血癥進行預測，以便及早進行干預治療，該項檢測容易在臨床中推廣使用。 2、不成熟大鼠肝臟葡萄糖醛酸轉移酶1A1活性很低，生后活性迅速增加達到成熟水平。研究結果提供了圍產(chǎn)期和成熟期UGT1A1活性的實驗依據(jù)?？梢赃x擇有效的時間段，對因肝臟葡萄糖醛酸轉移酶1A1活性不足導致的新生兒高膽紅素血癥進行基因治療。 3、本實驗成功構建了人類UGT1A1重組腺相關病毒載體，為因UGT1A1活性不足導致的高膽紅素血癥的基因治療奠定基礎