小鼠角質(zhì)化細胞生長因子及其受體的重組腺病毒表達載體的構(gòu)建.pdf

1、背景：角質(zhì)化細胞生長因子(KGF)是一種備受關(guān)注的細胞生長因子，其對肺泡上皮細胞(AECs)的多途徑、多水平的保護作用已經(jīng)廣為認可，既往研究表明KGF對急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)，以及肺纖維化(PF)均有預(yù)防作用，能夠明顯緩解病情改善預(yù)后。但是，就其應(yīng)用而言，主要存在如下問題：(1)KGF蛋白昂貴；(2)KGF目前僅限于預(yù)防。因此，構(gòu)建KGF、角質(zhì)化細胞生長因子受體(KGFR)的重組腺病毒載體對于探索肺部疾病的治

2、療；探討KGF，及其他細胞生長因子在肺損傷免疫進程中的作用都將是一個有力的工具。 目的：構(gòu)建表達小鼠KGF、KGFR基因的重組腺病毒。 方法：(1)根據(jù)小鼠KGF、KGFR基因序列，設(shè)計正向、反向引物；同時，提取小鼠肺組織RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)反應(yīng)，構(gòu)建cDNA文庫。構(gòu)建聚合酶鏈式反應(yīng)(PCPO反應(yīng)體系，擴增目的基因片段。(2)選擇pShuttle-CMV(卡那霉素抗性)作為載體質(zhì)粒，根據(jù)引物設(shè)計

3、所選擇的核酸內(nèi)切酶，對載體質(zhì)粒和目的基因片段進行雙酶切。將線性化的兩條DNA連接后，進行擴增，提取穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-KGF(pKGF)、pShuttle-CMVoKGF(pKGFR)。(3)核酸內(nèi)切酶Pme Ⅰ線性化pKGF、pKGFR，通過轉(zhuǎn)化含病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1(氨芐西林抗性)的大腸桿菌 BJ5183 以連接病毒骨架DNA，提取病毒質(zhì)粒pAdeasy-1-pShuttle-CMV-KGF(pAd-KGF)

4、，pAdeasy-1-pShuttle-CMV-KGFR(pAd-KGFR)，Pac Ⅰ酶切鑒定后，大量擴增質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細胞。提取重組腺病毒Adeasy-1-pShuttle-CMV-KGF(Ad-KGF)，Adeasy-1-pShuttle-CMV-KGFR(Ad-KGFR)，大量擴增，氯化銫梯度離心純化，測量病毒滴度。 結(jié)果：(1)DNA測序結(jié)果表明pKGF所載基因僅于第48bp處G突變?yōu)锳，考慮氨基酸翻譯簡并性，

5、不影響KGF表達；pKGFR則完全符合，提示成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒。(2)線性化穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183細菌后，細菌生長于含Kan的LB平板，同時Pac Ⅰ酶切顯示目的條帶，提示成功構(gòu)建含KGF、KGFR基因的病毒質(zhì)粒。(3)顯微鏡下觀察HEK293細胞出現(xiàn)病理形態(tài)變化，表明病毒合成并進行復(fù)制。(4)測得Ad-KGF、Ad-KGFR病毒滴度，分別為3.0×10<'11>PFU/ml、2.25×10<'11>PFU/ml。 結(jié)論：本實驗