桃microRNAs鑒定及內(nèi)參基因的篩選.pdf

1、MicroRNA（miRNA）作為一類植物內(nèi)源的、不編碼蛋白的小分子RNA，在植物的生長發(fā)育、組織器官分化及抗逆境方面起了重要的調(diào)控作用。桃是薔薇科研究的模式植物，也是世界重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一。桃miRNA及其靶基因在桃生長發(fā)育、果實(shí)調(diào)控等方面起重要作用。本文首先用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)桃基因組中的miRNA及其靶基因，并用RT-qPCR和RLM-RACE的方法對(duì)其中一部分預(yù)測(cè)的miRNA及其靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證;再通過高通量測(cè)序的方法鑒定出桃

2、中保守的miRNA及桃中特有的miRNA，用降解組測(cè)序的方法尋找桃miRNA的靶基因;最后篩選出了桃在非生物逆境條件下，研究miRNA表達(dá)最適合的內(nèi)參基因。主要結(jié)果如下:
　　1.利用桃基因組的數(shù)據(jù)和miRBase數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對(duì)桃的miRNA及其靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。根據(jù)miRNA在植物中的高保守性及miRNA前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，篩選出了110個(gè)保守的miRNA及43個(gè)靶基因，這些miRNA屬于37個(gè)miRNA家族。隨后

3、利用熒光定量PCR的方法對(duì)其中的25個(gè)miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證和組織差異表達(dá)，從熒光定量PCR的結(jié)果可以看出miRNA在不同的組織中的表達(dá)有差異。最后用RLM-RACE的方法對(duì)miR156和miR172的靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的切割位點(diǎn)都位于miRNA和它靶基因配對(duì)區(qū)域的第十到第十一個(gè)堿基之間。
　　2.采用高通量測(cè)序的方法對(duì)桃的miRNA進(jìn)行測(cè)序，不僅得到了屬于46個(gè)miRNA家族的721個(gè)保守的miRNA，還預(yù)測(cè)到了341

4、個(gè)新的候選miRNA。進(jìn)一步利用熒光定量PCR的方法對(duì)其中30個(gè)保守的miRNA及15個(gè)新的miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證和組織差異表達(dá)分析。
　　3.以桃的莖、葉、花為材料，構(gòu)建了三個(gè)降解組文庫，利用已測(cè)得的miRNA進(jìn)行分析，最后得到了655個(gè)保守miRNA的靶基因和85個(gè)新候選miRNA的靶基因。
　　4.以桃的‘早鳳王’品種為材料，對(duì)其幼苗進(jìn)行三種非生物逆境脅迫處理，用兩個(gè)常用的內(nèi)參基因5.8s rRNA、U6和桃的15個(gè)mi