豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是豬的一種高度接觸性傳染病。1978年該病病原豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)得到了首次鑒定。自2010年下半年以來(lái)，該病在我國(guó)的流行強(qiáng)度不斷擴(kuò)大，還伴有哺乳仔豬高死亡率等特點(diǎn)，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有建立一種標(biāo)準(zhǔn)化的，能在基層推廣使用的PEDV鑒別檢測(cè)方法。對(duì)國(guó)內(nèi)流行毒株進(jìn)行進(jìn)一步的

2、流行病學(xué)調(diào)查，并建立一種快速，準(zhǔn)確的鑒別診斷方法是了解我國(guó)PED流行狀況，更好的防控該病的前提，具有重要的實(shí)踐意義。本研究具體內(nèi)容如下:
　　1豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立與流行病學(xué)調(diào)查
　　針對(duì)PEDV的保守基因M建立了RT-PCR檢測(cè)方法，并證實(shí)其具有較高的敏感性和特異性。用建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)豬群中的PEDV流行情況進(jìn)行了調(diào)查，2011年3月至2012年12月間從9個(gè)省市共24個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的1

3、13份腹瀉病料的檢測(cè)結(jié)果顯示，有20個(gè)豬場(chǎng)70份樣品為PEDV陽(yáng)性，豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)到83.33％，樣品陽(yáng)性率為61.95％，說(shuō)明PED在當(dāng)前的腹瀉疫情中任然占主導(dǎo)地位，在仔豬腹瀉病防控過(guò)程中應(yīng)該著重加強(qiáng)對(duì)該病的綜合防控。
　　2PEDV部分S蛋白的原核表達(dá)
　　參考GenBank上已發(fā)表的PEDV基因序列，針對(duì)抗原位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其部分S基因片段，并將該片段定向插入到pET-28a中成功構(gòu)建出原核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌

4、BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳分析初步確定重組融合蛋白pET28a-S582能得以表達(dá)，并經(jīng)Westernblott鑒定該蛋白具有良好的反應(yīng)原性和穩(wěn)定性，為診斷試劑盒及基因工程疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)。
　　3PEDV間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　以重組的部分S蛋白作為包被抗原，建立了PEDV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。經(jīng)條件優(yōu)化，確定抗原最適包被濃度為4ug/mL，37℃包被2h，最佳封閉劑為1