轉基因作物檢測陽性質粒分子的研制及應用.pdf

1、隨著我國轉基因技術的不斷發(fā)展,轉基因作物產業(yè)化規(guī)模的不斷擴大,轉基因作物的種類和數量不斷增加,轉基因作物安全管理的任務將越來越繁重,尤其是非法釋放到環(huán)境中的轉基因產品時有發(fā)生,試驗階段轉基因生物的安全監(jiān)管工作將是我國轉基因生物安全管理的重點和難點。在試驗階段轉基因作物陽性樣品非常有限的情況下,如何根據轉基因作物本身的遺傳信息研發(fā)出容易獲取的、可大量生產的標準物質,以滿足轉基因作物安全監(jiān)管工作的需求至關重要,轉基因作物檢測陽性質粒分子是滿

2、足我國當前需要的最優(yōu)選擇。
　　本研究以處于試驗階段、尚未進入商業(yè)化應用、亟需研制標準物質的轉基因作物為研究對象,建立相應的檢測方法并制備適合這類作物的陽性質粒分子,來解決因無法大量獲得這些轉基因品種的基體陽性物質而難以進行轉基因檢測、監(jiān)測的難題。本研究取得的創(chuàng)新結果有以下幾個方面:
　　1、建立4個檢測方法。
　　根據耐除草劑G2-aroA基因、真菌來源的植酸酶基因序列、轉基因水稻T1c-19和T2A-15'端的轉化

3、體序列信息,通過引物設計與優(yōu)化,Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度梯度優(yōu)化,建立了G2-aroA基因和植酸酶基因,T1c-19和T2A-1事件特異性檢測方法。結果表明檢測方法均具有良好的特異性和靈敏度,靈敏度均能夠達到0.1％,可以滿足我國轉基因成分定性檢測對靈敏度的要求。
　　2、構建了適用于6大作物(水稻、玉米、大豆、棉花、小麥和油菜)篩查用的內標準基因陽性質粒分子pBS Endogenous。
　　根據國家標準中玉米內標

4、基因zSSIIb、油菜內標基因HMG I/Y、小麥內標基因waxy-D1、水稻內標基因SPS、棉花內標基因Sad1和大豆內標準基因Lectin序列信息,構建了內標準基因特異性檢測陽性質粒分子pBS Endogenous,實驗結果表明,該質粒具有較好的特異性和檢測靈敏度,能夠用于內標準基因擴增的陽性對照。
　　3、構建了7種基因特異性篩查檢測的陽性質粒分子pBar、pPAT、pEPSPS(Mo)、pEPSPS(Na)、pG2-aro

5、A、pCry1Ab/1Ac、pPhytase。
　　將轉基因檢測中常用的篩查基因Bar、PAT、CP4-EPSPS(天然的)、CP4-EPSPS(修飾的)、G2-aroA、Cry1Ab/1Ac、Phytase克隆至質粒載體中,研制了7種基因特異性陽性質粒分子,實驗結果表明這些質粒分子均具有很強的基因特異性,適合用于轉基因作物中的基因鑒別。定性PCR檢測靈敏度均能達到50拷貝μL-1,其中pG2-aroA檢測極限能夠達到10拷貝μL

6、-1。
　　4、研制了四種轉基因作物(水稻、棉花、玉米、大豆)的12種轉化事件特異性陽性質粒分子和2種構建特異性陽性質粒分子(pCV127-G和pBVLA430101-G)。其中pKF6、pM12、pT1c-19、pT2A-1、pKMD分別用于轉基因水稻科豐6號、M12、T1c-19、T2A-1和克螟稻1號的檢測;pEZM1、pNN98-7分別用于鄂雜棉1號、南農98-7的檢測;pA2704-12、pA5547-127、pCV12

7、7-Z分別用于轉基因大豆A2704-12、A5547-127、CV127的檢測;pBVLA430101-Z、pMIR162分別用于轉植酸酶玉米 BVLA43010和MIR162的檢測。實驗表明這些質粒分子在定性PCR檢測過程中,檢測極限均能達到50拷貝μL-1,其中pM12、pEZM1、pMIR162、pCV127-G檢測極限能夠達到10拷貝μL-1。
　　5、組織10家國內具有資質的檢測機構對所構建的4個檢測方法和研制的22種陽