家蠶尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因BmUGT4965的克隆和真核表達(dá).pdf

1、糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)是自然界廣為存在的一大類酶，在動(dòng)物、植物、細(xì)菌和病毒中都有發(fā)現(xiàn)，催化活化糖供體(通常是尿苷二磷酸-糖，UDP-糖)的糖基轉(zhuǎn)移到受體分子(苷元)上，完成糖基化反應(yīng)。糖基化反應(yīng)改變了苷元的性質(zhì)，如生物活性、溶解性和在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的特性，在生物體內(nèi)行使多種功能。糖供體包括UDP-葡萄糖醛酸(UDP-glucuronic acid)、UDP-葡萄糖(UDP-glucose)、UDP-半乳糖(UDP-galactose)、UDP

2、-木糖(UDP-xylose)等，而受體分子包括各種內(nèi)源和外源化合物。哺乳動(dòng)物尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)利用UDP-葡萄糖醛酸作為糖供體，催化許多內(nèi)源底物如膽汁酸、類固醇等化合物的糖基化，參與其在體內(nèi)的代謝和平衡調(diào)節(jié)。此外還催化外源化合物如致癌物、有毒物質(zhì)和治療用藥物的糖基化反應(yīng)，參與解毒反應(yīng)和藥物清除。植物中的UGTs主要以UDP-葡萄糖作為糖供體，催化內(nèi)源底物包括植物激素和二級(jí)代謝產(chǎn)物的糖基化，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、幫助植物抵御環(huán)境

3、壓力等生理過程中起重要作用，此外還參與除莠劑等異生物質(zhì)的解毒過程。
　　 哺乳動(dòng)物特別是人類的UGTs，由于參與致癌物解毒和治療用藥物的代謝清除，在制藥和臨床研究上的潛在價(jià)值引起廣泛關(guān)注而得到了深入的研究，植物中關(guān)于UGTs的研究報(bào)道也較多，而昆蟲中則相對(duì)較少。現(xiàn)有的研究表明昆蟲中的UGTs與相關(guān)的哺乳動(dòng)物和植物中的這類酶有著許多相似的特征，在昆蟲中起著同等重要的作用。家蠶已發(fā)展成為研究鱗翅目昆蟲的重要模式生物，其體內(nèi)有多個(gè)UG

4、Ts，研究家蠶的UGTs基因具有重要意義——不僅可以闡明其在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過程中擔(dān)負(fù)的功能，同時(shí)也可為其它昆蟲UGTs基因的研究提供重要的分子依據(jù)。本文克隆了家蠶中的一個(gè)尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因BmUGT4965，分析了其序列特征，檢測(cè)了在家蠶幼蟲5齡第3天各組織中的表達(dá)情況，真核表達(dá)了該基因，并檢測(cè)了其對(duì)供試底物的催化活性。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1 BmUGT4965基因的克隆和序列分析
　　 克隆了BmUG

5、T4965基因(NCBI登錄號(hào)：EU873318)，該基因定位于第25染色體上，完整編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1578bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，且所有的外顯子/內(nèi)含子拼接邊界均符合典型的GT-AG規(guī)則。BmUGT4965基因編碼的蛋白含有UDPGT典型結(jié)構(gòu)域，分為N-末端和C-末端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。與其它序列的比對(duì)表明其C端部分氨基酸序列比較保守，而負(fù)責(zé)結(jié)合結(jié)構(gòu)多樣的苷元的N端部分保守性較低。與哺乳動(dòng)物UGTs一樣，BmUGT4965蛋白定位

6、于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是膜結(jié)合蛋白。其N端含有信號(hào)肽，緊接著是一段非常保守的序列，哺乳動(dòng)物UGTs該區(qū)域可能參與寡聚體形成，另外N端還有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。這些表明其天然形式可能是個(gè)寡聚體，而且是糖蛋白。該蛋白C端區(qū)域含有一個(gè)跨膜區(qū)，緊接著是一段富含堿性氨基酸的序列，這兩段區(qū)域共同作用將其錨定在內(nèi)置網(wǎng)膜上，而N段區(qū)域伸入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。
　　 2 BmUGT4965基因的組織表達(dá)分析
　　 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BmUGT4965基因

7、在家蠶幼蟲5齡第3天的中腸、血液、絲腺、體壁、頭、脂肪體、馬氏管、精巢和卵巢共9個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明其在絲腺和脂肪體中表達(dá)量較高，在中腸和馬氏管中有微弱表達(dá)。表達(dá)的組織特異性較高。
　　 3 BmUGT4965基因的真核表達(dá)
　　 構(gòu)建重組表達(dá)載體，利用Bac to Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Hi-5細(xì)胞中表達(dá)融合的目的蛋白，通過SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)，表達(dá)得到了約為64.5kDa的

8、目的蛋白。
　　 4 BmUGT4965蛋白活性檢測(cè)
　　 以槲皮素和山奈酚作為底物，檢測(cè)重組表達(dá)蛋白的粗酶催化活性，結(jié)果表明外源表達(dá)的BmUGT4965蛋白能夠催化這兩種底物，分別生成兩種和一種產(chǎn)物。
　　 桑葉中黃酮類化合物被家蠶中腸吸收后先在其5-O位置經(jīng)一步糖基化，其產(chǎn)物經(jīng)血液進(jìn)入絲腺和脂肪體中后，在4'-O位置再一次被糖基化修飾。BmUGT4965蛋白可能參與了后面這一步代謝，從而促成蠶繭中的黃酮類化合