豬甲狀腺激素應(yīng)答基因(SPOT14)的克隆與原核表達.pdf

1、甲狀腺激素應(yīng)答基因(Thyroidhormoneresponsivegene，SPOT14)是受甲狀腺激素誘導(dǎo)表達的核內(nèi)基因，在動物肝臟、脂肪組織中高表達，該基因參與脂肪合成代謝途徑限速酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對動物脂肪生成具有重要的調(diào)控作用。為進一步研究豬SPOT14基因所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本試驗基于電子延伸序列，設(shè)計其克隆引物，利用RT-PCR方法成功克隆了豬SPOT14基因，并檢測了該基因在各組織的分布情況。進而構(gòu)建了豬SPOT14基

2、因的原核表達載體pET-28α(+)-S14，并誘導(dǎo)表達了融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析和Westernblot檢測確定該融合蛋白為S14，其蛋白分子量為20.91kD。結(jié)果表明：
　　 1.豬SPOT14基因的克隆、序列分析與組織分布。
　　 克隆的豬SPOT14基因包含一個完整的開放閱讀框架(openreadingframe，ORF)，長度為453bp，編碼由150個氨基酸組成的S14蛋白(GenBank：JF

3、951726)，其中酸性氨基酸35個，堿性氨基酸23個，蛋白質(zhì)分子量為：17.08kD，等電點為：6.15。其氨基酸序列與人、牛、小鼠、褐鼠、兔、雞的同源性分別為76.9％、80.89％、76.2%、76.2%、82.1％、32.0％，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示豬與牛的親緣關(guān)系最近。該基因在肝臟和脂肪組織中高表達，在腦、脾臟、胃、皮膚、盲腸、直腸中表達量相對較低，在肺臟、十二指腸、空腸、回腸中微量表達，在腎臟、肌肉中無表達。
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4、.豬pET-28α(+)-S14原核表達載體的構(gòu)建與鑒定
　　 為了獲取S14的蛋白質(zhì)分子，本試驗根據(jù)克隆序列合成一對表達引物，將豬SPOT14基因的ORF片段克隆到原核表達載體pET-28α(+)中，經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定、測序鑒定，確定豬SPOT14基因插入的位置、大小和讀碼框均正確，證實成功構(gòu)建了原核表達載體，將其命名為DET-28α(+)-S14。
　　 3.豬SPOT14基因在大腸桿菌中的表達
　　

5、 將獲得的重組質(zhì)粒pET-28α(+)-S14轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)感受態(tài)細胞，分別用不同終濃度的IPTG和不同的誘導(dǎo)表達時間進行誘導(dǎo)，以確定蛋白表達的最佳條件。在最佳誘導(dǎo)條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳檢測，表達的融合蛋白分子量約為21kD，且主要以包涵體形式存在。
　　 4.豬pET-28α(+)-S14重組蛋白的純化與鑒定。
　　 將獲得的包涵體用6xHi