大黃魚頭腎SSH cDNA文庫(kù)構(gòu)建及兩個(gè)重要生理功能分子(BPI、DP1)的生物學(xué)特征和功能研究.pdf

1、大黃魚是我國(guó)近海特有的主要經(jīng)濟(jì)魚類和當(dāng)前最主要海水養(yǎng)殖魚類之一，目前關(guān)于大黃魚的基礎(chǔ)免疫學(xué)和生理學(xué)方面的研究還比較少。為了獲得涉及大黃魚的基礎(chǔ)免疫學(xué)和生理學(xué)方面的重要的差異表達(dá)基因，本研究以肽聚糖為免疫刺激劑，用抑制性差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了大黃魚受肽聚糖刺激后頭腎差異表達(dá)基因的cDNA文庫(kù)，并結(jié)合RACE-PCR技術(shù)對(duì)其中2個(gè)重要生理功能的分子(BPI、DP1)進(jìn)行了克隆鑒定及生物學(xué)特征和功能研究。本研究取得的主要結(jié)果包括3個(gè)方面

2、：
　　 1 cDNA文庫(kù)分析結(jié)果
　　 在構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)中，隨機(jī)挑取克隆測(cè)序得到196個(gè)EST，組裝后得到149個(gè)unique gene, GenBank編號(hào)為EB643250-EB643371和GO271613-GO271637，其中26個(gè)有明確的注釋，根據(jù)其功能和作用可以被分為10類，其中5個(gè)與免疫反應(yīng)相關(guān)，3個(gè)線粒體基因，3個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，5個(gè)蛋白激酶類分子，2個(gè)癌基因，2個(gè)微衛(wèi)星基因，2個(gè)細(xì)胞骨架基因，1

3、個(gè)RNA水平相關(guān)因子，1個(gè)雄性不育基因和1個(gè)核糖核蛋白。2大黃魚殺菌通透增強(qiáng)蛋白Pc-BPI的生物學(xué)特征和功能研究
　　 該基因cDNA全長(zhǎng)為1919 bp（GenBank序列號(hào)：DQ917778），開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1419 bp，編碼472個(gè)氨基酸。大黃魚Pc-BPI的氨基酸序列與其他物種的同源物的相似性為25-36％。在Pc-BPI的N末端(5.02e-31)和C末端(1.93e-32)分別包含一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物BPI/LBP/

4、CETP的結(jié)構(gòu)域。
　　 Pc-BPI在正常大黃魚各組織中為普遍性表達(dá)，在鰓、脾、頭腎中的表達(dá)量比其它被檢組織表達(dá)高，其表達(dá)水平可被福爾馬林滅活的諾卡氏菌(FI-Ns)和福爾馬林滅活的溶藻弧菌(FI-Va)誘導(dǎo)。
　　 表達(dá)了大黃魚Pc-BPI基因的N末端和C末端的原核重組蛋白(rBN、rBC)，和Pc-BPI全蛋白的真核表達(dá)產(chǎn)物(rBO)。rBN有強(qiáng)烈殺滅哈維氏弧菌的作用，對(duì)從患病海水養(yǎng)殖魚類中分離到的溶藻弧菌和副溶血

5、弧菌也能有效殺滅。
　　 制備了針對(duì)rBN的兔抗血清，免疫組化研究顯示，Pc-BPI的表達(dá)在腎組織中的陽(yáng)性反應(yīng)較弱，而脾和頭腎組織中陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)烈，且主要在各組織細(xì)胞的實(shí)質(zhì)性細(xì)胞和脾臟血竇的內(nèi)皮細(xì)胞及腎小管的上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，在實(shí)質(zhì)性細(xì)胞的細(xì)胞核中也有輕度的表達(dá)。3大黃魚重要的生理功能分子——轉(zhuǎn)錄因子Pc-DP1的生物學(xué)特征和功能研究
　　 克隆和表達(dá)了大黃魚重要的生理功能分子——轉(zhuǎn)錄因子Pc-DP1(GenBa

6、nk序列號(hào)：DQ821446)。其cDNA全長(zhǎng)1427 bp,具有一個(gè)1239 bp的讀碼框，編碼412個(gè)氨基酸。大黃魚Pc-DP1蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能上都非常保守的蛋白，Pc-DP1的氨基酸序列與斑馬魚的DP1的相似性最高(88％)，與爪蟾、人和鼠的相似度均為78％。Pc-DP1氨基酸序列中包含一個(gè)典型的保守DNA結(jié)合區(qū)域(113-148)和一個(gè)與E2F亞家族蛋白結(jié)合為二聚體的區(qū)域(149-209)。大黃魚Pc-DP1蛋白的N端多為堿