家蠶Bm8K蛋白的分離純化及功能初探.pdf

1、在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，Insulin/IGFs信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控生物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝。這個(gè)系統(tǒng)的效應(yīng)因子具有保守性，特別是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)家族的N端和C端結(jié)構(gòu)域序列高度保守。其對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡都起著至關(guān)重要的作用。Insulin/IGFs系統(tǒng)是當(dāng)今生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其不管是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)還是在疾病治療方面，都具備有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)

2、也為其它昆蟲的研究提供重要的參考。而目前對(duì)無脊椎動(dòng)物IGFBPs的功能同系物少有報(bào)道。本論文主要對(duì)家蠶Bm8K蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分離純化Bm8K蛋白，對(duì)其功能進(jìn)行初步研究。主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶Bm8K基因的生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)Bm8K基因組序列，預(yù)測(cè)它出其由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其中內(nèi)含子的長(zhǎng)度為578bp，2個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別為193bp和110bp。通過TESS網(wǎng)站預(yù)測(cè)出以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+

3、1)上游的2500bp區(qū)域中有34個(gè)可能的胰島素信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。用在線ProtParam軟件分析，預(yù)測(cè)出Bm8K蛋白有5對(duì)二硫鍵，成熟肽的分子量約為8694Da，等電點(diǎn)為8.64。通過對(duì)Bm8K蛋白的氨基酸序列BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)的序列具有相似性，特別與IGFBPs的N端功能區(qū)域匹配程度較高。
　　 2.家蠶8K蛋白的分離純化及鑒定
　　 為了獲取天然的Bm8K蛋白，

4、將五齡三天的家蠶血液蛋白通過硫酸銨沉淀法，凝膠過濾層析和離子交換層析純化蛋白。利用MALDI-TOF質(zhì)譜和Western blotting對(duì)純化得到的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明純化得到的蛋白為單一的Bm8K蛋白。
　　 3.家蠶的加糖飼料喂養(yǎng)對(duì)Bm8K基因的表達(dá)影響
　　 從四齡開始對(duì)家蠶用添加了15％的葡萄糖的人工飼料喂養(yǎng)后，提取五齡三天家蠶脂肪體和頭的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板對(duì)Bm8K基因和Bombyxin

5、A3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析檢測(cè)它們的表達(dá)情況。結(jié)果表明，加糖飼料喂養(yǎng)家蠶使Bm8K基因和BombyxinA3基因都得到上調(diào)表達(dá)。
　　 4.Bm8K蛋白對(duì)家蠶卵巢細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響
　　 用不同濃度(25、50、100μg/mL)的Bm8K蛋白處理對(duì)數(shù)穩(wěn)定生長(zhǎng)期的卵巢細(xì)胞，對(duì)照組用等量的PBS處理，培養(yǎng)48h后，用Cell Counting Kit-8對(duì)卵巢細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，Bm8K蛋白能夠促進(jìn)家蠶卵巢