犬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)方法建立及其串聯(lián)表位卵黃抗體中和效力評(píng)價(jià).pdf

1、犬細(xì)小病毒感染是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引發(fā)犬類的一種接觸性傳染病。該病毒可引起犬急性腸炎、白細(xì)胞減少、嘔吐、以及幼犬心肌炎等病癥。犬細(xì)小病毒為單股線狀DNA病毒，其主要結(jié)構(gòu)蛋白是VP1和VP2。VP2基因全長(zhǎng)1755bP，決定CPV的抗原型和侵入宿主的特異性，并可編碼CPV的主要抗原決定簇和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。
　　 本研究從疑似CPV感染的病犬糞便及腸內(nèi)容物中分離得到2株CPV，分別命名為

2、DN7株和DN8株。并對(duì)兩株分離株與疫苗株C154的VP2基因進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)其核苷酸序列和氨基酸序列的同源性。結(jié)果表明：兩株CPV分離株相互間的核苷酸序列同源性為99.5％。兩株分離株DN7和DN8與疫苗株C154之間的同源性分別為98.6%、99.1%。DN7、DN8與國(guó)內(nèi)分離株BJ02007株核苷酸同源性最高分別為99.5%、100%，與國(guó)內(nèi)分離株V154核苷酸同源性最低分別為99.0%、99.4%，與韓國(guó)分離株DH426核苷酸同源

3、性最高分別為99.4%、99.8%，與日本分離株2c(b)核苷酸同源性最低，分別為99.0%、99.4%。通過(guò)進(jìn)化樹推測(cè)兩株分離株屬于CPV-2a型。
　　 本研究根據(jù)GenBank登錄的CPV(登錄號(hào)：GU569943.1)保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成2對(duì)LAMP引物，經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，特異性、敏感性試驗(yàn)和對(duì)臨床樣品的檢測(cè)驗(yàn)證，建立了CPV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法。結(jié)果顯示：所建立的LAMP檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性臨床樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊

4、脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出特征性梯狀條帶，陰性臨床樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后則無(wú)擴(kuò)增條帶，對(duì)犬細(xì)小病毒的最低檢出量為0.11×10-4μg/μL，其敏感性是PCR的100倍，是犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)試紙的1000倍。LAMP和PCR對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。表明所建立的LAMP檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速，對(duì)提高CPV的檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性有很大幫助。
　　 本研究采用表位串聯(lián)方法，將犬細(xì)小病毒的一段線性B細(xì)胞表位經(jīng)反復(fù)串聯(lián)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌原核表

5、達(dá)系統(tǒng)，獲得CPV的VP2基因B細(xì)胞線性表位重組蛋白。將表位串聯(lián)后的重組蛋白、DN7株、疫苗株C154共3種抗原作為免疫原分別對(duì)7月齡海蘭蛋雞進(jìn)行3次免疫后收蛋，用氯仿抽提法提取卵黃抗體。通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，測(cè)得3種不同抗原的卵黃抗體ELISA檢測(cè)效價(jià)最高值分別為1:1024、1:4096、1:2048。體外中和試驗(yàn)結(jié)果表明：卵黃抗體原液中和CPV的能力不強(qiáng)，但將卵黃抗體濃縮倍數(shù)增加，可以使卵黃抗體中和CPV的能力加強(qiáng)，對(duì)