禽病原性大腸桿菌E058株ompT、cvaC基因突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性.pdf

1、禽大腸桿菌病(Aviancolibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(AvianpathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的局部或全身性感染的疾病，主要包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫（Hjarre氏病）、滑膜炎、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、腹膜炎、輸卵管炎、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染等。該病給世界范圍內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，ompT基因編碼外膜蛋

2、白酶，cvaC是大腸桿菌素V的結(jié)構(gòu)基因，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ompT、cvaC基因在有毒力菌株中的陽(yáng)性率很高。本研究旨在研究ompT、cvaC基因與致病性之間的關(guān)系，了解APECompT與cvaC基因突變株的生物學(xué)特性，為揭示APEC的致病機(jī)理及進(jìn)一步構(gòu)建APEC弱毒疫苗株奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)運(yùn)用同源重組的方法構(gòu)建ompT和cvaC的基因缺失突變株。首先PCR擴(kuò)增ompT和cvaC基因，并將其插入到pMD(R)18-Tsimp

3、levector載體，再運(yùn)用分子克隆的方法將Zeocin抗性基因分別插入到目的基因ompT和cvaC中，構(gòu)建出帶Zeocin抗性基因標(biāo)志的載體T-ompT-Zeo和T-cvaC-Zeo，最后PCR擴(kuò)增片段ompT-Zeo和cvaC-Zeo，并電轉(zhuǎn)化禽致病性大腸桿菌分離株E058，篩選出E058突變株E058△ompT及E058△cvaC。
　　 Southernblot結(jié)果顯示Zeocin抗性基因片段單拷貝插入;RT-PCR結(jié)果

4、表明突變株的ompT基因及cvaC基因不能轉(zhuǎn)錄，但其上下游基因的轉(zhuǎn)錄正常;生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，突變株E058△ompT及E058△cvaC的生長(zhǎng)速度與親本株E058相似，并未表現(xiàn)出明顯差異;SPF雞血清殺菌試驗(yàn)、HD11細(xì)胞吞噬試驗(yàn)、12日齡SPF雞胚致死試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與野生株E058相比，突變株E058△ompT及E058△cvaC只表現(xiàn)出了輕微致弱;E058、E058△ompT、和E058△cvaC的半數(shù)致死量(LD50)為分別為

5、104.4、106.0和105.1CFU;體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)及動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)表明，與野生株相比，突變株E058△ompT在各個(gè)被檢臟器中數(shù)量均明顯下降，差異顯著，而E058△cvaC在部分被檢臟器中數(shù)量有所下降，但并未達(dá)到顯著水平，差異不顯著。結(jié)果表明，E058△ompT突變株較野生株毒力下降明顯，E058△cvaC突變株毒力較野生株相比沒(méi)有明顯的差異，從而表明ompT基因與APECE058株的致病性有關(guān)，cvaC與APECE058株的致病性不相關(guān)