ighccnd1融合基因--輔助診斷套細胞淋巴瘤。

1、分子技術(shù)在腫瘤靶向藥物治療的應(yīng)用,中南大學(xué)病理學(xué)系 湘雅醫(yī)院病理科,周建華,腫瘤靶向治療（Target therapy of cancer）,依據(jù)已知腫瘤發(fā)生的異常分子和基因，設(shè)計和研發(fā)針對這些特定的分子和靶點藥物，選擇性殺傷腫瘤細胞的治療方法；靶向治療的前提就是明確腫瘤的特異靶基因變異類存在與否和變異類型；個體化治療的雛形。,熒光原位雜交（ Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH ）技術(shù)

2、,簡介,FISH = Fluorescence In Situ Hybridization利用熒光標記的DNA探針檢測組織或細胞內(nèi)與其互補的DNA片段應(yīng)用：遺傳病診斷 血液腫瘤 實體瘤樣本：羊水、絨毛、流產(chǎn)組織、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等,FISH檢測染色體易位（Translocation）在淋巴瘤分型中的應(yīng)用,FISH技術(shù)在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用,檢測技術(shù)特點,不同類型的淋巴瘤染色體易位類型不同優(yōu)點適用于形態(tài)學(xué)

3、上難以診斷且IHC結(jié)果不理想的標本；適用于細胞數(shù)量少，形態(tài)不典型的活檢及穿刺組織。必須結(jié)合組織形態(tài)學(xué)和免疫組化結(jié)果作最后診斷?。?！,FISH基因檢測在淋巴瘤的應(yīng)用,彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL） 按免疫組化亞型分為 CD5陽性DLBCL 生發(fā)中心B細胞樣變型(GCB)、 非生發(fā)中心B細胞樣變型(non-GCB) 3類,可根據(jù)C

4、D10、BCL6、MUM1的表達區(qū)分生發(fā)中心B細胞樣變型、非生發(fā)中心B細胞樣變型。>30%瘤細胞表達CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)診斷為GCB;其他病例則為non-GCB。,◆ BCL6基因斷裂---輔助診斷彌漫性大B細胞淋巴瘤,◆ BCL6基因斷裂重排----判斷預(yù)后,目前研究確定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。,一項針對102名DLBCL患者的BCL6重排情況及其與預(yù)后關(guān)系的研究顯

5、示，BCL6陽性患者診斷治療36個月后，疾病停止發(fā)展的比率為82%，攜帶有BCL6重排的病例預(yù)后較好。,BCL6 基因斷裂與彌漫性大B細胞淋巴瘤,Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80.,結(jié)果判讀,IGH/CCND1融合基因可見于95%的套細胞淋巴瘤，是套細胞淋巴瘤與其他淋巴瘤鑒別的重要指標。,IGH/CCND1融合基因--輔助診斷套細胞淋巴瘤。,IGH/CCND1融合基因與套細胞淋

6、巴瘤,,l 正常細胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l 異常細胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。,API2/MALT1基因檢測試劑盒,探針：GLP API2/GLP MALT1,凋亡抑制因子2基因（apoptosis inhibitor-2,API2）,位于11號染色體;粘膜相關(guān)淋巴組織基因（Mucosa-associated lymphoid tissue 1 ,MALT1 ），位于18號染色體。,API2基因與

7、MALT1基因的融合導(dǎo)致凋亡抑制的增加，引起細胞不依賴于抗原刺激的生存優(yōu)勢。,API2/MALT1融合基因的檢測可以指導(dǎo)抗HP治療,胃MALT淋巴瘤與幽門螺旋桿菌（HP）感染導(dǎo)致的慢性胃炎有關(guān)，MALT1/API2融合基因陰性的患者抗HP治療有效，陽性患者抗HP治療無效。,API2/MALT1融合基因檢測意義,l 正常細胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l 異常細胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。,BCL2/IGH重

8、排發(fā)生在約80%-85%的FL患者中，檢測BCL2/IGH基因重排可以輔助診斷FL。,BCL2/IGH陰性的FL患者3年生存率為100%，而陽性者只有54%； 陰性者3年疾病無進展為87.5%，而陽性者只有13%。,BCL2/IGH融合基因與濾泡性淋巴瘤,BCL2/IGH融合基因-----輔助診斷濾泡性淋巴瘤,BCL2/IGH融合基因-----判斷預(yù)后,,l 正常細胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l 異常細胞：一個紅色信號，一

9、個綠色信號，兩個融合信號。,結(jié)果判讀-陽性結(jié)果,結(jié)果判讀-陽性結(jié)果,約80%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(8；14) （q24;q32）； 約15%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(2；8)(p11;q24)； 約5%發(fā)生t(8；22)（q24;q11）。 染色體易位導(dǎo)致C-MYC基因斷裂重組可能是伯基特淋巴瘤的一個標志，可以應(yīng)用于臨床上伯基特淋巴瘤的輔助診斷。,C-MYC基因斷裂與伯基特淋巴瘤,輔助診斷伯基特淋巴瘤,結(jié)

10、果判讀-陽性結(jié)果,FISH技術(shù)在乳腺癌靶向治療應(yīng)用,乳腺癌 Her-2基因,致癌基因：Her-2基因； 位點：17q11.2-q12； 編碼蛋白：跨膜蛋白（與 表皮生長因子受體部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴增； HER-2基因擴增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標。HER2擴增的乳腺癌更具有侵襲性生長能力。,乳腺癌Her-2基因及蛋白檢測,Cerb-B-2 :3+ 完全強

11、膜陽性細胞>30% 2+,1 +,- FISH檢測是否有基因擴增,基因突變檢測方法,1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage) 2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)3. 雜合雙鏈分析法(HA)4. 化學(xué)切割錯配(CCM) 5.碳化二亞胺檢測(Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割錯配(Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.單鏈構(gòu)

12、象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation)8.切割片段長度多態(tài)性 9.DNA測序(Sequencing) 10.雙脫氧指紋圖譜法(Dideoxy Finger-printing, ddF)11.錯配接合蛋白檢測 12.蛋白截短測試（protein truncation test）,方法,13.變性的高效液相色譜檢測(Denaturing High Performance Liguld Chromatog

13、raphy DHPLC) 14.DNA芯片技術(shù)(DNAchip) 15.等位基因特異性擴增16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-Specific Oligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(Primer Extension,PEX)18.寡核苷酸連接檢測(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA)19.限制性片段分析(Restriction Fragment Anal

14、ysis）20.突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）21.蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions amplification refractory mutation system）,肺癌組織EGFR基因擴增和突變檢測及其臨床意義,研究背景,研究顯示吉非替尼對部分晚期NSCLC患者的治療效果非常顯著。存在EGFR基因突變的患者更有可能對吉非替尼的治療敏感。 存在EGFR基因擴增的肺癌、腸癌病人對分子

15、靶點藥物更為敏感。檢測大腸癌有無EGFR過度表達，只要>1%的癌細胞的胞膜強陽性染色即判斷為3+，可作為應(yīng)用西妥昔單抗的指征。,,,,FISH檢測EGFR基因擴增標本類型：石蠟包埋組織（手術(shù)、活檢、穿刺） 冰凍組織 胸、腹水沉渣細胞 探針類型：GLP EGFR / CSP7 定量PCR檢測EGFR基因突變分型 突變類型： 19 exon （2235

16、-2249位點）15bp缺失突變 19 exon （2240-2257位點）18bp缺失突變 19 exon （2240-2251位點）12bp缺失突變 21 exon 2573位點T>G堿基置換突變 21 exon

17、2582位點T>G堿基置換突變,EGFR基因變異檢測,,,,,,FQ-PCR分型技術(shù)檢測EGFR突變,存在EGFR突變肺癌樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖,71例肺癌組織中檢測出6例突變樣本,FQ-PCR 檢測15bp缺失陽性病例結(jié)果,,紅色閾值線以上的擴增曲線即為陽性標本的擴增曲線，按熒光信號值的高低依次為 9號、12號、13號、55號、38號和33號標本,15bp缺失突變型DNA的測序圖,sense,antisense,目前K-RAS突

18、變檢測常用技術(shù),方法,直接測序焦磷酸測序高分辨率熔解曲線PCR-RFLP芯片雜交Real-Time PCR,腫瘤組織的確認和篩選,顯微切割腫瘤提取DNA,相應(yīng)的PCR反應(yīng)或雜交,相關(guān)的分析和檢測,,,,K-ras突變檢測基本流程圖,直接測序(Direct Sequencing),PCR擴增后產(chǎn)物直接測序雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法) DNA 片段是熒光標記的，這些片段經(jīng)過平板膠電泳或毛細管電泳得到分離，熒

19、光分子被激發(fā)而發(fā)光，發(fā)出的光信號被檢測系統(tǒng)檢測,,,,K-ras突變檢測結(jié)果,,療效預(yù)測標志物與預(yù)后判斷標志物,療效預(yù)測標志物：能夠預(yù)測某種特定治療方式療效的標記物KRAS基因突變導(dǎo)致腫瘤對EGFR抑制劑抵抗預(yù)后判斷標志物：在不考慮治療因素的情況下能夠判斷患者結(jié)局的標記物18號染色體長臂（18q）缺失 某些分子標志物兼具兩種作用胸腺嘧啶合成酶（Thymidylate synthase）,EGFR 作為預(yù)后因子的價值,

20、EGFR expression correlates with poor prognosis,DFS = Disease-free survival; OS = overall survival,Cetuxamab(西妥昔單抗)人源化嵌合單抗（ IgG1 ）靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）阻斷EGF 和TGFα與EGFR 的結(jié)合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的腫瘤生長200４年獲得FDA審批資格治療結(jié)直腸癌Panitumu

21、mab（帕尼單抗）完全人源化單克隆抗體(IgG2)靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）2005年7月獲得FDA快速通道審批資格治療結(jié)直腸癌,結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物,KRAS 突變,KRAS 突變可不依賴EGFR受體途徑，自行激活RAS/MAPK 通路導(dǎo)致ERBITUX 耐藥KRAS 突變與Erbitux療效及患者生存相關(guān)KRAS 突變并非孤立事件KRAS 突變常伴隨BRAF突變，并與 CpG 島甲基化表型(CIMP)1

22、,2相關(guān)KRAS 突變常伴隨 PI3K 突變3,Lièvre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374–379,MAPK = mitogen-activated protein kinase,K-ras基因野生型患者能從這類藥物治療中獲益。 K-ras基因突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用；,抗EGFR治療和K-ras突變相互排斥,K-ras基因抗EGFR治療

23、關(guān)系密切,2009年7月FDA批準了對西妥昔單抗和帕尼單抗說明書標簽的修改：,結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物,注明KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者不推薦這使用這兩種用藥物。,K-ras基因突變: 20-60%結(jié)直腸癌 K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因高度保持一致,K-ras基因突變,NCCN臨床實踐指南指南明確指出所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者 都應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)。 美國美國臨床腫瘤學(xué)會(

24、ASCO)推薦把K-ras基因突變檢測作為 結(jié)直腸癌患者接受EGFR單抗治療的預(yù)測指標。 歐盟藥品審評管理局規(guī)定：cetuximab 及panitumumab 用于mCRC的治療前，患者必須確定為K-ras野生型。,K-ras與結(jié)直腸癌治療,結(jié)直腸癌（CRC）缺乏EGFR基因突變,對愛必妥單藥治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）臨床試驗中110例活檢標本進行的研究未發(fā)現(xiàn) EGFR基因突變（外顯子18－21）,Khambata

25、-Ford S, et al. J Clin Oncol 2007;25:3230–3237,,,抗EGFR治療前檢測KRAS基因突變的理由,避免不必要的不良反應(yīng)控制不必要的費用確認能夠從治療中獲益的野生型患者避免治療對突變型患者的潛在毒性,CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29, 2008 — but for patients with wild-type KRAS t

26、umors,,,810名胃癌病人有HER2基因的擴增，約占參與實驗總?cè)藬?shù)的22%；晚期胃癌接受標準化療聯(lián)合Herceptin治療的患者：平均生存期由11.1個月延長到13.8個月； 高倍擴增者甚至可達16個月； 將死亡風(fēng)險降低26%。,HER2與胃癌分子靶向治療,美國臨床腫瘤學(xué)會ASCO提出：,Herceptin可成為HER2陽性晚期胃癌患者的 治療選擇。 晚期胃癌患者在確診時都應(yīng)接受HER2檢測；,HER基因與胃癌預(yù)