羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)在hbv耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用

1、羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)在HBV耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用,,,羅氏診斷 應(yīng)用科學(xué)市場(chǎng)部 劉璐璐,HBV 耐藥性產(chǎn)生,病毒每天高速?gòu)?fù)制，并在復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤，這些自發(fā)突變導(dǎo)致突變株出現(xiàn)。突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。但在病毒藥物作用下，藥物對(duì)于耐藥性的突變有選擇作用，導(dǎo)致了耐藥菌株成為優(yōu)勢(shì)株，導(dǎo)致藥物治療的失敗。,www.454.com,耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測(cè)的意義治療前檢測(cè)，有助于臨床判斷用藥是否有效；

2、治療中每 3~6個(gè)月檢測(cè)，有助于觀察療效，及時(shí)調(diào)整用藥,EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.,用藥后出現(xiàn)耐藥,拉米夫定 阿德福韋酯 恩替卡韋 替比夫定

3、 替諾福韋,測(cè)序用于病毒耐藥檢測(cè)深度測(cè)序可檢出低頻準(zhǔn)種,提早判斷準(zhǔn)種組成，在劣勢(shì)菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌種之前，即調(diào)整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對(duì)身體傷害。,454高深度測(cè)序優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)于RT基因區(qū)段1%突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測(cè)序及線性探針反向雜交法更加靈敏進(jìn)行相對(duì)定量，對(duì)于病毒群體中突變數(shù)量改變進(jìn)行跟蹤深度測(cè)序的運(yùn)用將較傳統(tǒng)方法提前3-6個(gè)月檢測(cè)出突變，因此能夠更好的抓住治療的時(shí)機(jī)并給出治療的方案,—

4、,454測(cè)序系統(tǒng)發(fā)展測(cè)序通量及讀長(zhǎng)不斷增加，大小測(cè)序平臺(tái)齊備,—,GS 20,GS FLX Standard,2005,2007,2008,—,,,Future,Even Longer Reads,Higher Density,Later,GS FLX Titanium,GS Junior Titanium,GS FLX+,2011,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室適用型精巧型 二代測(cè)序平臺(tái) GS Junior,GS Junior 測(cè)序步驟概覽,Mi

5、x ssDNA & capture beads,454 測(cè)序流程 文庫(kù)構(gòu)建,1. 454文庫(kù)構(gòu)建：Shotgun Paired-end300bp~1Kb, 3Kb, 8Kb, 20Kb*PCR產(chǎn)物可直接測(cè)序,傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu)建：BAC克隆->Shotgun/PCR,一個(gè)片段 = 一個(gè)反應(yīng)珠,454 測(cè)序流程 emPCR,2. emPCR每個(gè)DNA分子獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)后獨(dú)立測(cè)序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高GC含量片段、甚

6、至FFPE樣本,一個(gè)反應(yīng)珠 = 一個(gè)讀長(zhǎng),單克隆測(cè)序的價(jià)值通過 emPCR實(shí)現(xiàn)單克隆,直接閱讀每一種分子結(jié)果突變比例的計(jì)算（低頻）基于實(shí)際的序列信息每個(gè)DNA分子獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)后獨(dú)立測(cè)序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高 GC含量片段、甚至FFPE樣本,Sanger 流程-混合測(cè)序,454 流程-單克隆測(cè)序,454測(cè)序流程 測(cè)序,特異的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合, 加入一種dNTP DNA 聚合酶的作用下，單個(gè) dNTP與模板的下一

7、個(gè)堿基配對(duì)，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi) 在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS結(jié)合形成ATP在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉 Apyrase降解剩余的dNTP和殘留的少量ATP加入另一種dNTP重復(fù)2-5步驟在每一個(gè)測(cè)序循環(huán)里，堿基以同樣的次序(TACG)流過PicoTiterPlate板當(dāng)模板鏈的互補(bǔ)核苷酸加入延伸鏈時(shí)，會(huì)產(chǎn)生了熒光信號(hào)熒光信號(hào)強(qiáng)度

8、與所加入的核苷酸數(shù)目成比例熒光信號(hào)被CCD照相機(jī)記錄,熒光素酶,ATP 硫酸化酶,氧化熒光素,可見光,3. 基于焦磷酸反應(yīng)的邊合成邊測(cè)序,13,Sequencing By Synthesis,,,,,,,A A T C G G C A T G C T A A A A G T C A,,,,,C,T,A,Repeated d

9、NTP flow sequence:,G,G,T,C,A,G,T,C,A,G,T,T,T,T,C,A,G,G,A,T,C,C,C,G,A,T,T,G,C,T,A,Anneal Primer,Process continues until user-defined number of nucleotide flow cycles are completed.,邊合成邊測(cè)序,,實(shí)驗(yàn)體系的不斷優(yōu)化使得當(dāng)前可獲得Junior 平均為400bp

10、的讀長(zhǎng)并將繼續(xù)以提升讀長(zhǎng)為技術(shù)的發(fā)展方向之一,454測(cè)序流程 數(shù)據(jù)獲取,圖像處理,信號(hào)處理,454測(cè)序流程數(shù)據(jù)分析,測(cè)序與分析同時(shí)進(jìn)行，10小時(shí)完成10小時(shí)產(chǎn)出 10萬條以上的序列自帶4套軟件，滿足多數(shù)應(yīng)用需求軟件自動(dòng)過濾，高質(zhì)量序列比例高400bp 的位置仍可保持Q20的準(zhǔn)確性,,GS Junior在德國(guó)大腸桿菌事件中Nicholas J Loman et al., Performance comparison of

11、benchtop high-throughput sequencing platforms, Nature Biotechnology, 2012 [DOI: 10.1038/nbt.2198]454 GS Junior擁有最長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，平均讀長(zhǎng)在522個(gè)堿基，99%的序列可以用于基因組拼接6月3日收到樣本，6月5日完成全部測(cè)序與機(jī)制確認(rèn)工作數(shù)據(jù)分析僅由HPA的非專業(yè)生信團(tuán)隊(duì)，不到半天時(shí)間即得到結(jié)果,www.454.com,序列讀長(zhǎng)

12、分布圖,Junior 測(cè)序系統(tǒng)運(yùn)行產(chǎn)生的讀長(zhǎng)范圍為50-600bp，甚至更長(zhǎng) shot gun實(shí)驗(yàn)將利用幾乎全部數(shù)據(jù)平均讀長(zhǎng)為400bp典型讀長(zhǎng)在 450-550bp范圍 Amplion 實(shí)驗(yàn)將主要根據(jù)典型讀長(zhǎng)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì),CGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCT,Complex,,,Short read techno

13、logy,454 長(zhǎng)測(cè)序能夠帶來什么emPCR 保證樣本的獲得，長(zhǎng)焦磷酸確保閱讀,長(zhǎng)讀長(zhǎng)的價(jià)值,一條reads通讀一個(gè)目標(biāo)序列，無需拼接，避免錯(cuò)誤產(chǎn)生與時(shí)間消耗通過一條reads判斷突變的連鎖關(guān)系更少引物獲得更多目標(biāo)引物設(shè)計(jì)的區(qū)間更靈活Junior1條reads 既可通讀HBV耐藥相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物,The Journal of Infectious Disease, May 2009; 199(9): 1275-85.,

14、PCR擴(kuò)增子文庫(kù)的設(shè)計(jì)長(zhǎng)讀長(zhǎng)給予更多引物設(shè)計(jì)空間，1條reads通讀熱點(diǎn)突變區(qū)域,454 B-primer (19 bp),,Locus specific PCR amplification,emPCR & 雙向測(cè)序,,Target specific sequence (ca. 25 bp),,454 A-primer (19 bp),,,,,,,,,,,,,,,,,,,Sequence of interest,,200 –

15、400 bp,通過MID序列，可以混合多個(gè)樣本測(cè)序同時(shí)測(cè)序,,Data analysis,RT基因可設(shè)計(jì)3個(gè)PCR產(chǎn)物片段S基因可設(shè)計(jì)2個(gè)PCR產(chǎn)物片段C基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段X基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段Pre-C基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段,454測(cè)序在HBV 耐藥基因測(cè)序的應(yīng)用方案,454 測(cè)序步驟HBV耐藥檢測(cè)應(yīng)用,emPCR(乳滴PCR)擴(kuò)增每一帶有MID與測(cè)序引物的HBV耐藥突變高發(fā)DNA片段在其各自的微乳

16、滴中進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，排除了其它競(jìng)爭(zhēng)性或污染性序列對(duì) PCR反應(yīng)的影響。焦磷酸測(cè)序?qū)⑺薪Y(jié)合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進(jìn)行測(cè)序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。將PTP板置于GS測(cè)序儀中，單個(gè)核苷酸依次流經(jīng)孔洞和DNA捕獲磁珠間。當(dāng)所加入的核苷酸與模板互補(bǔ)時(shí)，便產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，進(jìn)而被GS系統(tǒng)的CCD相機(jī)記錄。,454的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測(cè)單點(diǎn)突變,454的分析結(jié)果呈現(xiàn)可關(guān)注已知突變,Mul

17、tiple Mutations in a Codon Associated with NRTI Resistance,,,T69,Confidential,Multiple Mutations in a Codon Associated with NRTI Resistance,,Thr69 ? 35% Alanine, 42% Asparagine, and 1.2% Serine,,,,Confidential,454的分析結(jié)果

18、呈現(xiàn)可檢測(cè)有意義的連鎖突變位點(diǎn),已有RT基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)Standford HBVSeq,www.454.com,Standford HBVSeq結(jié)果展示,www.454.com,近兩年使用454 發(fā)表HBV耐藥檢測(cè)文獻(xiàn),Analysis of hepatitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencing. Ko SY, Oh HB, P

19、ark CW, Lee HC, Lee JE. (2012) Clin Microbiol Infect ePub:Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quantifies linkage of drug-resistant amino Acid changes in the hepatitis B virus genome. Rodriguez-

20、Frías F, Tabernero D, Quer J, Esteban JI, Ortega I, Domingo E, Cubero M, Camós S, Ferrer-Costa C, Sánchez A, Jardí R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. (2012) PLoS One 7

21、(5):e37874.Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic hepatitis B virus (HBV)-infected patient exposed to several unsuccessful therapy schemes. Sede M, Ojeda D, Cassino L, Westergaard

22、 G, Vazquez M, Benetti S, Fay F, Tanno H, Quarleri J. (2012) Antiviral Research ePub:Ultra-deep pyrosequencing analysis of the hepatitis B virus preCore region and main catalytic motif of the viral polymerase in the sam

23、e viral genome. Homs M, Buti M, Quer J, Jardí R, Schaper M, Tabernero D, Ortega I, Sanchez A, Esteban R, Rodriguez-Frias F. (2011) Nucleic Acids Research ePub:,GS Junior測(cè)序系統(tǒng)您身邊的二代測(cè)序平臺(tái),,經(jīng)典可靠：運(yùn)用454測(cè)序技術(shù)，與GS FLX測(cè)序系統(tǒng)相同