pet表達載體

1、表達載體表達載體pETA.pET系統(tǒng)是有史以來在系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)。中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬菌體T7強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50%以上。盡管該系統(tǒng)極

2、為強大，卻仍能很容易地通過降低誘導物的濃度來削弱蛋白表達。降低表達水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分產量。該系統(tǒng)的另一個重要優(yōu)點是在非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄。用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白對宿主細胞的可能毒性造成的質粒不穩(wěn)定(詳見I.F.部分)。如果用非表達型宿主細胞克隆，可以通過兩種方法啟動目的蛋白的表達：用帶有受λpL和pI啟動子控制的T7RNA聚合酶的λCE6噬菌體侵

3、染宿主細胞，或者將質粒轉入帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表達型細胞。在第二種情形下，可以通過在細菌培養(yǎng)基中加入IPTG來啟動表達。盡管有時(例如非毒性目的蛋白)可以直接將目的基因克隆到表達型宿主細胞中，但這種策略并不是通用做法。兩種T7啟動子以及多種擁有不同抑制本底表達水平的宿主細胞共同構成了一個極為靈活而有效的系統(tǒng)，使各種目的蛋白得以最優(yōu)化表達。所有pET載體以及相關產品均以試劑盒形式提供，用戶可以很方便地進行克隆、表

4、達檢測以及純化目的蛋白的所有操作。pET表達系統(tǒng)包括質粒和宿主菌。您可參考系統(tǒng)組成部分，選擇符合具體需要的載體宿主菌最佳組合。B.使用許可及協(xié)議使用許可及協(xié)議Novagen的T7表達系統(tǒng)，包括細菌、噬菌體和帶有T7RNA聚合酶基因的質粒，均依照非商業(yè)用戶應用聲明相應條款有條件提供。詳情請垂詢。C.系統(tǒng)組成系統(tǒng)組成pET表達系統(tǒng)提供目的基因克隆和表達所需的核心試劑。選定的pET載體DNA，10g宿主菌BL21，BL21(DE3)以及BL2

5、1(DE3)pLysS甘油菌12?目的蛋白的應用?目的蛋白已知特定信息?克隆策略pET載體的應用多種多樣。例如分析級表達量的蛋白用于活性分析，篩選及確定突變，篩選配體相互作用，制備抗原等。大量活性蛋白用于結構研究，作為試劑或制備親和基質。可能有多種載體都能滿足表達用于篩查或抗原制備所需的分析級表達量的要求，但是，能用于大量純化的載體宿主菌培養(yǎng)條件的最佳組合條件往往是唯一的。如果要連續(xù)生產大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索載體宿主菌

6、培養(yǎng)條件的組合以便找到最佳條件，是非常值得的。任何有關目的蛋白的信息都有助于選擇合適的載體。例如，有些蛋白表現(xiàn)活性要求一端或兩端均無外源序列。大多數(shù)pET載體可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻譯起始序列在E.coli中不能被有效使用，表達水平也會受到一定的影響。在這種情況下，通常是構建一種帶有高效表達的氨基末端序列的融合蛋白(參見pET載體特點總表，第7頁，N端融合表達)，并在純化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。不需連接反應的克隆(

7、LIC)在這種情況中特別有用，可以通過腸激酶或Xa因子切去所有載體編碼的氨基末端序列(參見pET載體特點總表，第7頁)。不同的克隆策略、對限制性酶切位點及閱讀框的不同要求，會影響對載體的選擇。許多pET載體具有同樣的限制性酶切位點，用戶可以僅準備一次目的插入片段，將其插入到多個載體中。不同的要求可以考慮采用不同的PCR克隆策略。LIC載體試劑盒是一種非常有用的產品，可以用來以PCR制備插入片段卻避免了限制性酶切消化載體和插入序列的操作。

8、蛋白溶解性及細胞定位蛋白溶解性及細胞定位一旦確定了用途和克隆策略，下一步就是判斷目的蛋白在細胞中的定位和可溶性。許多后續(xù)應用要求目的蛋白以具有生物活性的可溶狀態(tài)表達。而目的蛋白的可溶性常常受很多因素影響，包括特定的蛋白序列等。在大多數(shù)情況下，可溶性并非有或無的現(xiàn)象，載體、宿主菌及培養(yǎng)基的不同選擇可以增加或降低可溶不溶蛋白的量。正確選用合適的載體和宿主菌組合會明顯提高目的蛋白可溶部分比例及活性。載體可以通過三種方式改善目的蛋白的溶解性或正