新型疫苗疫苗及其分類附加

1、,一、轉基因植物疫苗,疫苗的研究和開發(fā)歷程,以全細胞疫苗為標志的第一次疫苗革命以乙型肝炎基因工程疫苗為典型代表的第二次疫苗革命第三次疫苗革命:基因疫苗研究,轉基因植物疫苗的技術基礎,重組基因技術 實際上是重組DNA疫苗的一種生產疫苗的系統(tǒng):高等植物轉基因植物口服疫苗，例如水果、黃瓜、胡蘿卜和番茄等轉基因的植物疫苗具有效果好、成本低、易于保存和免疫接種方便等優(yōu)點，因此特別適合于包括中國在內的發(fā)展中國家的需要。,轉基因植物疫苗的

2、研究方向,一種是利用植物作為工廠采生產大量的蛋白質抗原，然后經過分離和提純，再制備成疫苗；另一種是不需要分離和提純，將植物或其某部分作為可以直接口服的疫苗。,轉基因植物疫苗的優(yōu)越性,(1)植物細胞的全能性 植物的組織或原生質體在適當的條件下經培養(yǎng)能得到一株完整的可育的植物體。(2)完整的真核細胞表達系統(tǒng) 在植物中表達的產物可進行糖基化、酰胺化、磷酸化和亞基的正確裝配等翻譯后的加工過程，使表達產物具有與高等動物細胞表達一致的免疫

3、原性及生物活性。,轉基因植物疫苗的優(yōu)越性,(3)誘導粘膜免疫反應 口服植物疫苗能誘導機體產生粘膜分泌性IgA。人體粘膜是阻擋某些病原體與人體接觸的第一道屏障。粘膜免疫的產生對某些傳染病，尤其是通過粘膜傳播的傳染病的預防是非常有效的。 (4)生產簡便、成本低廉 用動物或微生物生產疫苗需要特殊的條件和設備，并需要冷藏和低溫運輸。植物種植是最經濟的蛋白質生產系統(tǒng)。從消耗的能源來說，陽光是植物用之不盡的能源，營養(yǎng)來自土壤中的肥料、礦物質和

4、水，無需專門的設施和昂貴的設備。轉基因植物的種子可用以再生產和技術轉讓。非常適合發(fā)展中國家的需要。,轉基因植物疫苗的優(yōu)越性,(5)接種簡便 植物疫苗的接種途徑主要是口服，無需注射。如果給嬰幼兒喂服香蕉泥疫苗，不再受皮肉之痛苦，無疑會受到家長們的歡迎。(6)安全性 植物疫苗在本質上是人類的食品，因此安全可靠，無毒性和副作用，也無潛在的致病和致癌的危險性。,轉基因植物種類的選擇標準：,該植物可以在世界上較多地區(qū)，特別是發(fā)展中國家種植，

5、并能獲得較高的產量；容易給嬰幼兒喂服，并能獲得家長們的接受；作為疫苗的植物可食用部位必須是可以生食的，并且有較高的蛋白質含量,(1)煙草,煙草一直是進行植物組織培養(yǎng)和遺傳轉化的模式植物，較為容易獲得轉基因植物。雖然煙草含有尼古丁等有害物質，但其蛋白質含量豐富，可通過純化技術獲得蛋白質，所以較適合于如乙型肝炎等轉基因植物疫苗的生產及應用研究。,(2)馬鈴薯,遺傳轉化系統(tǒng)已經建立，在很短時間內即可獲得大量的轉基因植物；可食用的塊莖組

6、織特異性啟動子已被克隆，可以使外源基因在塊莖內特異地大量表達。組織培養(yǎng)快速繁殖系統(tǒng)業(yè)已成熟，可以供應大量遺傳背景一致的種苗。馬鈴薯可以作為很多動物的食物，所以動物實驗絕無問題。致命的缺點:即馬鈴薯塊莖蛋白質的含量較低，而且人類無生食馬鈴薯的習慣。,(3)香蕉,在發(fā)展中國家有大量的種植，而且價格非常便宜。每個香蕉可以表達1～10mg左右的外源基因蛋白質，大約100～500μg的蛋白質抗原就足以刺激人體產生特異的免疫反應，因而一個轉

7、基因的香蕉疫苗就能給10個嬰幼兒進行口服免疫接種。,其他植物,豆類植物的種子雖然含有較高的蛋白質，而且轉基因豆類作物的研究也有較多成功的報道。但是豆類種子中含有凝集素類物質，因而不能生食。大部分蔬菜和水果類植物含有較多的水分，蛋白質的含量很低，顯然也很不適合作為轉基因植物疫苗的表達載體。,非直接口服的轉基因植物疫苗乙型肝炎表面抗原疫苗,目前市場上用的疫苗是用酵母細胞系統(tǒng)生產的DNA重組乙肝病毒表面抗原疫苗將乙肝表面抗原基因轉入煙草

8、的基因組,結果發(fā)現煙草成功表達了乙肝表面抗原。,乙型肝炎表面抗原疫苗,發(fā)現煙草源性的乙肝表面抗原能夠產生抗乙肝表面抗原的抗體，除了IgG1低于酵母源性疫苗外，IgG2、IgG3、IgM和IgA的滴度均高于后者。這些抗體能識別人血清中的乙肝表面抗原。體外實驗也證明煙草源性的乙肝表面抗原保留了相同的T細胞及B細胞抗原決定簇。雖然煙草源性的乙肝表面抗原產生抗體比較慢，而且滴度略低于現有的疫苗，但煙草提取液只含3％的蛋白質，而酵母源性的疫苗

9、卻是純化的蛋白質制劑。,諾瓦克病毒衣殼蛋白,引起腹瀉。Mason等人用煙草來表達諾瓦克病毒衣殼蛋白取得成功。表達量達到煙葉總蛋白質含量的0．23％。對這種植物源性的蛋白質結構進行分析發(fā)現，它不但保留了抗原決定簇，而且能更加耐受蛋白酶的分解。在電鏡下觀察，其形狀類似于NVLPs。用轉基因馬鈴薯去喂小鼠，在小鼠血清中測到了抗諾瓦克病毒的IgG和IgA抗體。,狂犬病病毒糖蛋白,McGarvey等人將狂犬病病毒的表面蛋白在番茄中表達，且表

10、明它能與病毒天然蛋白質產生的多克隆抗體形成免疫沉淀。他們還用植物病毒為載體得到狂犬病植物疫苗，并且在被免疫的小鼠血清中測到了中和抗體。,直接口服的轉基因植物疫苗大腸桿菌腸毒素植物疫苗,產腸毒素型大腸桿菌引起腹瀉在感染性腹瀉的免疫機制中，粘膜免疫重要用轉基因植物作為口服疫苗有可能產生理想的粘膜免疫反應，從而達到預防腹瀉性傳染病的目的。 Mason等人于2019年根據這個原理將LT-B的編碼基因轉入煙草及馬鈴薯，研制成功轉基因植物

11、疫苗,結核轉基因植物疫苗,卡介苗結核DNA疫苗已在小鼠實驗中獲得了可喜的免疫保護效果口服能表達結核桿菌蛋白質抗原的植物，有可能在肺部產生特異IgA抗體等粘膜免疫反應把結核桿菌分泌性蛋白質MPT-64和ESTA-6基因導人煙草、黃瓜、番茄和胡蘿卜的研究正在進行之中，其中MPT-64蛋白質的基因已經在番茄中獲得了成功的表達。,動物傳染病的轉基因植物疫苗,家畜都是生吃植物的，因而轉基因植物的選擇范圍比較廣。Carrillo等報道了他們

12、用編碼家畜口蹄疫病毒結構蛋白VP1的基因轉入到植物擬南芥中，然后用轉基因植物的葉子提取液來免疫小鼠，發(fā)現產生的特異性抗體能保護小鼠抵抗口蹄疫病毒的侵襲。,轉基因植物疫苗研究的發(fā)展方向,優(yōu)化重組基因無抗生素抗性的轉基因植物轉基因植物疫苗的穩(wěn)定性,優(yōu)化重組基因,①在插入基因的3’端加上微粒體保留信號SEKDEL多肽序列，使合成的蛋白質能保留在細胞的內質網部位，不會分泌出來，從而提高產量。②選擇特異的啟動子?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動子是

13、一個常用的啟動子，適合于多種植物。對馬鈴薯來說，patadin啟動子更為適合。在啟動子3，端加上煙草蝕刻病毒5，端的非翻譯區(qū)也是一種提高表達的方法。③編碼甘氨酸的GGG在單子葉植物基因組中非常少見，因此將插入基因中的這一編碼改為GGA是一種更適合在植物中表達的方法。④其他的方法包括去除虛假的mRNA加工信號、減少A—T含量、選擇植物偏愛的密碼子等。,無抗生素抗性的轉基因植物,在轉基因植物的再生過程中抗生素作為篩選標記被廣泛應用。人

14、類和動物在口服疫苗后，抗生素基因也勢必由此進人體內，這會使人感到擔憂。有關在轉基因植物的子代去除抗生素基因的策略已有不少。這些策略包括cre／lox重組子和轉座子系統(tǒng)，或利用改變代謝途徑和共轉化等方法。其中共轉化較容易操作，其基本原理是將一個具有抗生素標記的質粒和另一個僅含目的基因質粒同時導人同一農桿菌。由于不同質粒的基因一般插入到植物基因組的不同部位，可以通過有性生殖而分離，在子一代的植株中就可以篩選得到無抗生素基因而只含有目的基

15、因的轉基因植物。,轉基因植物疫苗的穩(wěn)定性,植物細胞壁的天然生物膠囊作用雖然能使植物疫苗避免在消化道中過早降解，但如果它久久不能釋放也顯然是致命的缺點。尋找一個最佳平衡點，使植物疫苗在最合適的部位發(fā)揮作用也是一個研究方向。,展望,雖然植物疫苗離臨床應用還為時尚遠，但這一領域充滿了希望，吸引著廣大科學研究者。在眾多轉基因植物疫苗的研究中，最有可能成為商品化的植物疫苗是轉基因香蕉。,香蕉具有其他植物無可比擬的3大優(yōu)點：,①香蕉泥已經是能被

16、廣泛接受的嬰幼兒食品②香蕉是蛋白質含量最高的水果之一③香蕉有厚實的外皮，保存和運輸都十分方便。,二、黏膜疫苗,,粘膜,是人體先天性免疫系統(tǒng)中很重要的防止病原微生物入侵的生理防線粘膜能將機體的內環(huán)境和外環(huán)境隔離開來，有效地將致病因子和對機體有害物質攔阻在外；粘膜的分泌液可防止病原微生物在其表面生長，并可通過排泄或咳痰等生理過程將它們清除出去,黏膜免疫系統(tǒng)的組成,亦稱為黏膜相關淋巴組織(MALT)是指廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿

17、生殖道黏膜固有層和上皮細胞下散在的無被膜淋巴組織以及某些帶有生發(fā)中心的器官化的淋巴組織，如扁桃體、小腸的派氏集合淋巴結(Peyer's patches，PP)及闌尾等。,黏膜免疫應答的誘導,啟動黏膜免疫發(fā)生的場所主要是一種特化扁平上皮細胞-微褶細胞(microfoldcell,M細胞)其功能為選擇性黏附,攝取外來抗原物質并以小囊泡形式轉運給上皮內淋巴細胞以及生發(fā)中心淋巴組織,誘導黏膜免疫應答,M細胞--各種病原微生物侵入機體的

18、門戶,M細胞(microfold cell)是表面具有粗糙皺折結構，覆蓋在粘膜表面的濾泡相關上皮組織FAE中 M細胞的表面是稀疏的絨毛狀結構，這有利于M細胞攝取大分子抗原，甚至細菌和病毒，抗原穿越粘膜的屏障，傳送到下面的淋巴組織中去，誘導產生特異的粘膜免疫反應,M細胞總結,M細胞是誘導和產生粘膜免疫反應場所的門戶，在那里發(fā)生了細胞的內飲和抗原的傳送、及隨后的病原微生物的殺滅、抗原的加工、處理和呈遞，以及抗原的儲存等一系列過程，最后誘導

19、和產生了粘膜免疫反應。,,,黏膜免疫的優(yōu)點,口服疫苗可在粘膜局部產生特異的抗體反應，來有效地阻止病原微生物的入侵甚至將其殺滅和清除出體外。通過口服或滴鼻接種疫苗，可以使機體全部的粘膜獲得抵御相應傳染病的免疫保護力。粘膜免疫也能產生很高的血清抗體效價，甚至能誘導細胞毒T淋巴細胞的活性。接種比較方便，副作用小，安全性好，生產方便，成本也比較低。,人用黏膜疫苗,脊髓灰質炎疫苗滅活霍亂全細胞B亞單位疫苗和減毒滅活苗減毒傷寒疫苗BCG

20、活疫苗腺病毒疫苗AIDS疫苗?,IgA抗體介導的粘膜免疫保護效果,抗原的攝取、加工、處理和呈遞，并激活抗原特異性的淋巴細胞，然后通過局部的淋巴結，進入全身性循環(huán)，再回到粘膜組織產生第二階段的免疫效應。此時的B淋巴細胞產生了克隆性的增殖，在再度接觸抗原和輔助性T淋巴細胞分泌的細胞因子的作用下，發(fā)生了向IgA漿細胞分化的過程，進而產生大量的特異性IgA抗體,IgA抗體,免疫球蛋白總量的80％是IgA抗體在粘膜局部合成的分泌性sIgA

21、，每天隨分泌物排泄出去的sIgA的數量可高達10g,分泌性IgA的結構與功能,sIgA的多聚體結構能增強其對抗原和病原體的親和力；sIgA表面特殊的糖成分或糖鏈有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。粘膜上皮細胞產生的分泌體(secertory component，SC)很快以二硫鍵共價連接成sIgA并分泌到粘膜的表面,能延緩小腸中蛋白酶對sIgA的降解作用，卻不影響它與抗原的親和力。,,黏膜免疫途徑,鼻腔免疫 和口服

22、 在許多情況下，鼻腔免疫更為有效，所需的疫苗量和佐劑量一般較小，且可以靶向病原體侵入的天然門戶，同時避免了胃腸道的酸性環(huán)境及酶的作用對抗原的破壞,黏膜免疫在禽病防治中的作用,經滴鼻、點眼、飲水和噴霧途徑免疫弱毒活疫苗，均可產生SIgA而建立相應的黏膜免疫力。檢測雛雞l—5日齡期間，局部免疫器官包括眼結膜和哈氏淚腺內，缺乏免疫活性細胞和黏膜抗體，而當1日齡接受疫苗免疫后，該部位的免疫活性細胞開始增多，說明早期免疫對免疫器官的活化至關重

23、要。,艾滋病黏膜疫苗的現狀及未來方向,胃腸道和陰道黏膜是HIV進入機體和初始感染的主要部位,能預防HIV感染的疫苗必須能夠誘導長期的黏膜免疫應答實驗證實,小鼠口服免疫包裹于微粒的質粒DNA能產生HIV特異性全身及黏膜CD8+CTL應答。另一項小鼠研究中,僅在陰道或直腸局部免疫HIV重組Sindbis病毒后方可觀察到抵抗HIV重組Sindbis病毒攻擊的保護作用,而肌肉注射或經遠端黏膜部位(如鼻腔)接種相同疫苗載體則不能為小鼠提供抵

24、抗陰道攻擊的保護作用。,三、治療性疫苗,,概念的提出,20世紀90年代的中期。美國Scripps的Chisari小組在2019年所發(fā)表的文章中即提出了therapeutic vaccine。自2019年之后，治療性疫苗愈來愈受到研究小組和公司廠商的重視，研究和開發(fā)工作迅速發(fā)展，尤其是HIV預防性和治療性疫苗受高度重視和支持。2019年至2000年前后，治療性疫苗或其相關研究成果及其文章如雨后春筍般涌現在最近三四年間，治療性疫苗的研

25、制工作在多種重點疾病領域廣泛開展起來，尤其在AIDS、慢性乙肝、腫瘤、自身免疫病、移植排斥等疾病治療上已獲得可喜的或相當有啟示性的結果，進一步激勵了大量的后續(xù)研究工作。,治療性疫苗的意義,傳統(tǒng)疫苗的基本性質 慢性疾病極度困擾人們在已感染或已患病個體誘導免疫應答,治療性疫苗的概念,是指有別于傳統(tǒng)預防性疫苗的、具治療作用的新型疫苗。它主要應用于發(fā)生慢性感染、腫瘤、自身免疫病、移植排斥、超敏反應等患者，發(fā)揮治療疾病的功能，有時兼具預防功

26、能。,治療機制,主動地激活患者的自身免疫力通過強化疫苗靶抗原的抗原性、激活并提高機體免疫系統(tǒng)對靶抗原的識別和效應閾或改善免疫系統(tǒng)的總體平衡來實現治療的目的,治療性疫苗與預防性疫苗的不同設計思路和原理的差異：,預防性疫苗著眼于普遍性、安全性和有效性，因此靶抗原主要為病原體本身或其天然的結構成分治療性疫苗著眼于病患的特殊性，以其致病的關鍵機理為突破口，靶抗原的選擇更傾向于功能明確的病原體表位、基序、顯現多肽或由此經分子改造和重組的非

27、天然的新型分子等，針對性加強。,,為增強免疫效果，治療性疫苗經常聯合應用形式多樣的新型免疫技術和手段，并輔以細胞因子、共刺激分子、趨化因子等分子佐劑，輔助手段因疾病種類、人群、病程、病因不同而不一。預防性疫苗僅提供免疫保護力；而治療性疫苗則主要提供治療作用，兩種疫苗的結合應用可真正實現疫苗對人體健康的全面、有效的保護作用。,治療性疫苗的種類,基于組成成分及性質的分類 新型治療性疫苗在形式上呈多樣組合，但在組成成分及性質上，可分

28、為蛋白質、基因和細胞等3種類型。,1,蛋白質復合重構的治療性疫苗,免疫禁忌、免疫無能和免疫耐受狀態(tài) 在蛋白質水平上進行修飾在組合上可有多蛋白的復合及多肽偶聯等抗原—抗體復合物,2,基因疫苗,DNA疫苗和RNA疫苗 體內表達抗原使其在空間構象、抗原性上更接近于天然抗原可模擬體內感染過程及天然抗原的MHCⅠ和MHCⅡ的呈遞過程可誘生抗體和特異性CTL應答便于在基因水平上操作和改造生產周期短，經濟實用,3,多水平基因修飾細胞疫

29、苗,以輔助分子修飾腫瘤細胞及DC細胞，可增強其免疫原性，達到治療性目的。通常所用的修飾分子有細胞因子如IL-2、IL-12、IFN-γ、GM-CSF等，有協(xié)同刺激分子如B7-1、B7-2、CD40、CD28、CD3等，有趨化因子如RANTES、IP-10及MHC分子等。修飾可發(fā)生于多環(huán)節(jié)上，如偶聯表達、共構建、質粒轉染、共注射等，發(fā)揮的輔助作用也各不相同。,,基于治療疾病種類的分類根據治療性疫苗主要針對的疾病的種類可將其分為5種類

30、型。,1,感染性疾病的治療性疫苗,感染性疾病通常伴隨病原體的持續(xù)存在和Th1型免疫應答的下調 重點在于清除病原體的持續(xù)性感染和上調Th1型免疫應答,2 腫瘤治療性疫苗,人體自身細胞失控后惡性增殖的結果 通過獲得對自身細胞生長的有效控制而真正消退腫瘤,3 自身免疫性疾病的治療性疫苗,系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SIE)、類風濕關節(jié)炎、自身免疫腦脊髓炎(EAE)等 在于對自身抗原反應的克隆失清除、失無能和失耐受 自身免疫性疾病發(fā)病與自身免疫

31、表位誘生的Th細胞應答有關，其治療性疫苗設計重點在于重新消除對自身抗原的特異反應性T細胞克隆,4 移植用治療性疫苗,用于抗移植慢性排斥反應的治療性疫苗可通過封閉協(xié)同刺激分子、誘導對移植物的免疫耐受來延長移植物的存活期 以多肽疫苗體外封閉移植物協(xié)同刺激分子等治療性疫苗的設計,5 變態(tài)反應治療性疫苗,變態(tài)反應疾病屬常見病，其中的各類過敏和哮喘有致命危險 思路有:細菌未甲基化的CpG基序或人工合成的CpG寡核苷酸被認為具強免疫調節(jié)力，

32、可誘導Th1免疫偏離，從而有效抑制Th2依賴的變態(tài)反應,影響治療性疫苗效果的因素及其可能機理,增強機體對疫苗的攝入 改善對疫苗靶抗原的有效處理 增強對靶抗原的有效呈遞 誘生全面的免疫應答,治療性疫苗分子設計的基本策略,疫苗靶抗原的改造和組合 以抗原表位為基礎的疫苗設計模擬天然病原體感染 多水平基因修飾 不同類型疫苗的交替新型佐劑的輔助作用 疫苗和基因治療的聯合應用,,治療性疫苗的應用,治療性疫苗是在全球慢性病毒性疾病廣

33、泛流行和腫瘤疾病缺乏治療手段的情況下應運而生的新型疫苗。其目的希望通過免疫已感染或已患病機體，重新喚起、激發(fā)和增強機體所缺乏或下調的特異性免疫應答，清除感染病原體或突變的細胞，治愈疾病也可通過誘導某些免疫抑制功能，緩解或治療超敏反應或自身免疫性疾病。,慢性病毒性肝炎的治療性疫苗,在法定報告的傳染病中，病毒性肝炎的發(fā)病率和死亡率均占首位我國乙型肝炎疫苗于1982年面世，經過約20年的推廣應用，取得了較好的預防效果，但對已感染者無效

34、發(fā)展新型乙肝治療性疫苗，具有必要性和緊迫性，它的應用前景和潛在的市場都是十分巨大的,HBV和HCV慢性感染的機制,機體不能誘生有效的特異性免疫應答，尤其是病毒特異性的CTL應答。研究證實在HBV和HCV慢性感染者中，特異性CTL的數量和活性明顯下降，不足以清除肝細胞內感染的病毒；Th1類細胞因子，如IFN-γ和TNF-α分泌下調。,傳統(tǒng)重組DNA疫苗的治療作用,主要用于乙型肝炎的預防。最近的研究顯示由傳統(tǒng)肌肉注射改為皮內注射傳統(tǒng)HB

35、V疫苗，可大為改善免疫應答，并且可在對肌肉免疫無應答人體內誘生較好的特異性抗體和CTL。臺灣學者以重組DNA的HBV疫苗免疫慢性HCV患者，發(fā)現既無毒性也無明顯降低病毒復制的效果，但可改善肝損傷。提示對傳統(tǒng)HBV疫苗的修飾和改造也應成為治療性疫苗的設計思路之一。,基因疫苗,基因疫苗誘生特異性細胞免疫應答的優(yōu)勢使其在治療性疫苗設計中格外受到重視。 Hu等以編碼HCV核心抗原的基因疫苗免疫BALB／c小鼠，并以核心蛋白加強免疫，結果誘生

36、了很好的特異性體液和CTL應答。,若干新型治療疫苗的提出,澳洲學者認為在慢性HBV或HCV感染基礎上重疊感染HAV，可通過上調Thl型細胞因子，如IFN-γ、IL-2、TNF-α等增強CTL強度而使HBV或HCV病毒的復制大為下降，因此建議HAV疫苗作為HBV或HCV的治療性疫苗我國科學家提出用抗原—抗體復合物(immune complex，IC)疫苗治療HBV慢性感染的方案。發(fā)現IC通過Pc受體介導可增強APC對抗原的攝取和改善抗原

37、的呈遞，上調IL-2和IFN-γ的分泌和提升IgG 2a的比例,已進入臨床試驗的慢性肝炎治療性疫苗,其一為多肽脂化提高免疫原性其二是在免疫誘生和效應發(fā)揮中以HTL表位輔助CTL表位功能,艾滋病的治療性疫苗,在短短20年間，席卷全球，迄今已感染4000萬人，死于AIDS的人數高達1 170萬，2019年的每天新感染人數達15000，非洲部分國家成人感染率高達32％，僅在肯尼亞每天新感染者就達500多人。,,AIDS使患者的免疫系統(tǒng)遭受嚴

38、重的破壞，多重繼發(fā)感染嚴重，死亡率極高核苷抑制劑AZT、3TC及蛋白酶抑制劑RTV組成的“雞尾酒”，新研制的藥物還有PRO542、Cyanovirin-N、AOP-RANTES、T-20等等，均為抑制HIV有效進入細胞的小分子物或蛋白。,靶抗原的選擇應有效阻斷HIV的感染,首選的靶抗原是包膜蛋白gp160、gp120，以此設計的在細菌、酵母、哺乳動物細胞中表達的疫苗至少有13種已經應用于臨床的預防評估。寡聚gp120被認為具有更佳的

39、抗原性，而將構象考慮在內的以分子間二硫鍵偶合的gp120-gp41糖蛋白疫苗可能更有利于阻斷HIV的入侵。包膜蛋白表面的多糖基化及莖環(huán)結構可遮蔽表位，因此去糖基化或阻斷莖環(huán)結構形成均有利于增強靶抗原的免疫原性。,展望,有若干種疾病治療性疫苗已進人Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗 治療性疫苗也面臨著許多理論和技術上的尚未解決的難題 治療性疫苗的開發(fā)在極大程度上依賴于感染性疾病、腫瘤、自身免疫病、移植免疫機理的闡明，病因學基礎研究上的突破，聯合疫苗

40、的策略，疫苗研制的工藝、接種疫苗的途徑等技術，才有可能加快治療性疫苗出臺的步伐,四、腫瘤疫苗,,研究原由,腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的一種重要手段， 已成為抗腫瘤研究的熱點之一。腫瘤疫苗通過接種引起細胞免疫， 激發(fā)人體自身的天然抗腫瘤反應達到防治腫瘤的目的。它適應了現代腫瘤治療中強調靶向性的要求， 它的設計力求最大程度地誘導針對腫瘤的特異性免疫應答， 在應用中需要克服的關鍵環(huán)節(jié)是腫瘤的免疫逃避。,機體抗腫瘤的免疫機制,機體抗腫瘤的免疫

41、反應包括非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫， 前二者的作用微乎其微。體內的抗腫瘤免疫反應主要是Ｔ細胞介導的細胞免疫，它包括ＣＤ８+Ｔ細胞的特異應答和ＣＤ４+Ｔ細胞的輔助效應， 最終對腫瘤細胞形成直接殺傷作用的主要是細胞毒性Ｔ淋巴細胞。腫瘤疫苗的研究都聚焦在細胞毒性Ｔ淋巴細胞特異性殺傷的誘導上。,抗腫瘤免疫應答的簡單過程,腫瘤抗原經抗原呈遞細胞（ＡＰＣ）攝取后在胞內經蛋白酶降解成短肽并運輸至內質網經過加工后和ＭＨＣ抗原，主要為主要組

42、織相容性復合體Ⅰ（ＭＨＣ－Ⅰ）類分子結合成ＭＨＣ－肽復合物，再運送定位至細胞表面。ＣＤ８+Ｔ細胞主要是細胞毒性Ｔ淋巴細胞的Ｔ 細胞受體識別該復合物并引發(fā)一系列的連鎖免疫反應。在該過程中,ＡＰＣ和ＭＨＣ抗原扮演了重要的角色。,腫瘤免疫逃避,腫瘤細胞絕大多數的大分子抗原都與人體的正常細胞相同， 屬共同自身抗原， 免疫系統(tǒng)無法識別。腫瘤細胞的特異性抗原表達低下， 免疫應答很難激發(fā)。腫瘤疫苗的理想效應是在不損傷正常體細胞的前提下， 克服腫瘤

43、的免疫逃避， 誘導免疫系統(tǒng)專一識別腫瘤特異性抗原， 引發(fā)一個足以殺傷或消滅腫瘤的免疫反應。,解決的關鍵問題,在腫瘤疫苗的設計中要是能否很好地確定腫瘤細胞特異性抗原在眾多同種類型的腫瘤患者中該抗原是否一致免疫系統(tǒng)能否通過對該抗原的識別激發(fā)特異性的免疫應答,腫瘤疫苗分類,腫瘤細胞疫苗腫瘤多肽疫苗腫瘤基因疫苗腫瘤樹突狀細胞疫苗（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ， ＤＣ），,1,腫瘤細胞疫苗機制,是在機體腫瘤組織中提取腫瘤細胞， 經滅活

44、處理后使瘤細胞喪失致瘤性， 但仍保持其免疫原性和抗原性， 將其主動免疫機體， 在理論上能提供腫瘤細胞的所有抗原， 包括特異性抗原和廣譜性抗原， 以期形成抗腫瘤免疫應答。,,特異性抗原表達低下，免疫原性低， 常無法誘導有效的抗腫瘤免疫應答。因此， 通常采用在疫苗中加入誘導免疫的細胞因子， 或導入細胞因子的編碼基因，或導入協(xié)同共刺激分子的編碼基因， 借此來達到增強疫苗免疫原性的目的。白細胞介素 ２、白細胞介素 ４ 和粒－巨噬細胞集落刺激因

45、子（ＧＭ－ＣＳＦ）,2,腫瘤多肽疫苗,通過提取高純度的腫瘤細胞特異性抗原多肽， 即所謂的優(yōu)勢表位， 來激發(fā)特異性更強的針對腫瘤的Ｔ細胞免疫。在設計上強調優(yōu)勢表位。但是，穩(wěn)定性較差， 在缺乏有效保護時易被降解，致使免疫效果不佳。作為抗原表位的多肽是ＭＨＣ限制性的，只有與適合的ＭＨＣ分子結合并被ＡＰＣ呈遞出來才能起效。,改善多肽疫苗的效能,通過對多肽表位氨基酸序列的修飾 無論肽序列怎么改變，必須使修飾后的表位能夠被Ｔ細胞識別，否

46、則就失去意義。 添加一些免疫佐劑: 熱休克蛋白、ＧＭ－ＣＳＦ和鳥苷－寡脫氧核苷酸,3,腫瘤基因疫苗,是利用基因工程技術將編碼腫瘤特異性抗原的基因結合于表達載體上 （ 重組病毒或質粒 ＤＮＡ） ， 再將疫苗直接注入機體， 借助載體本身和機體內的基因表達系統(tǒng)表達出期望的抗原， 從而誘導出專一性的細胞免疫應答。,基因疫苗的特點,優(yōu)點:目的基因在體內充分表達， 將打破腫瘤免疫耐受， 顯示出較強的免疫原性， 能夠長期穩(wěn)定地誘導特異性的

47、抗腫瘤免疫反應。缺點: 由于腫瘤患者免疫功能不足， 基因表達低下， 致使基因疫苗還不能顯示出充分有效的抗腫瘤免疫。提出的疫苗增強方案:是在基因重組過程中加入刺激免疫的細胞因子或協(xié)同共刺激分子基因， 增強疫苗誘導腫瘤免疫的潛能。,4,腫瘤ＤＣ疫苗,ＤＣ是專職的ＡＰＣ，它是目前公認的未致敏Ｔ細胞最強有力的誘導刺激細胞。在腫瘤患者中，ＤＣ的成熟和功能均有缺陷，這就有必要在活體外制備ＤＣ疫苗，之后將結合腫瘤抗原的疫苗接種至體內。,腫瘤ＤＣ

48、疫苗制備,在體外用腫瘤細胞特異性抗原致敏ＤＣ 后， 將致敏ＤＣ接種至體內，或是用負載瘤細胞特異性抗原編碼基因的ＤＣ進行接種。ＤＣ將誘導特異性的Ｔ細胞免疫應答，殺傷腫瘤細胞，隨后尚能激發(fā)免疫記憶，對腫瘤的復發(fā)有明顯的免疫抑制作用，并能持續(xù)較長的時間。,目前， 制備 ＤＣ 疫苗較為肯定的方法有如下 ３ 種：,腫瘤細胞融合ＤＣ疫苗 腫瘤抗原肽負載ＤＣ疫苗 腫瘤基因導入 ＤＣ 疫苗,(1)腫瘤細胞融合ＤＣ疫苗,先將腫瘤細胞經射線照射滅活，

49、 再采用細胞融合技術使之與ＤＣ融合腫瘤抗原可直接在融合細胞內被加工呈遞， 保證了抗原的完整有效及充分呈遞， 省略了一些抗原提純等較為繁瑣的中間步驟Ｓｉｄｅｒｓ用電融合技術融合腫瘤細胞與 ＤＣ 制備疫苗， 并在荷瘤小鼠中誘導了特異性的抗腫瘤免疫,(2)腫瘤抗原肽負載ＤＣ疫苗,提取腫瘤細胞的裂解物或提純腫瘤抗原， 將提取物與 ＤＣ 共同培育， 在此過程中有效抗原即被 ＤＣ 攝取呈遞， 用這種已致敏的 ＤＣ 疫苗進行接種， 可誘導出特異性

50、較強的免疫應答。Ｙｕ 等用惡性膠質瘤細胞裂解物致敏 ＤＣ， 用該疫苗免疫惡性膠質瘤患者后， 在體內誘導了特異性的細胞毒性 Ｔ 淋巴細胞反應。Ｌｉｕ等將癌胚抗原肽負載 ＤＣ， 用該疫苗治療晚期結腸癌， 在患者體內檢測到癌胚抗原特異的 Ｔ 細胞反應。,(3)腫瘤基因導入ＤＣ疫苗,通過質粒轉染、逆轉錄病毒載體、重組腺病毒或腫瘤 ＲＮＡ 電穿孔等基因工程技術將編碼腫瘤特異性抗原的基因導入 ＤＣ， 再免疫機體。該類疫苗的特點是導入的基因在

51、體內能夠長期表達腫瘤靶抗原， 并不斷被ＤＣ 呈遞， 能有效打破免疫耐受， 維持一個較為穩(wěn)定的免疫保護狀態(tài)， 是當今較為推崇的一種改良 ＤＣ 疫苗。Ｍｏｒｓｅ 等將編碼癌胚抗原和協(xié)同共刺激分子的基因導入 ＤＣ， 用該疫苗免疫機體治療結直腸癌， 誘導了有效的抗腫瘤免疫。,其他腫瘤疫苗,顆粒性肽－ＤＮＡ 復合疫苗超抗原疫苗抗獨特型抗體疫苗,A,顆粒性肽－ＤＮＡ 復合疫苗,將多肽疫苗和基因疫苗進行綜合， 設計出新型顆粒性肽－ＤＮＡ 復合

52、疫苗。它可有效激發(fā)抗原特異性 Ｔ 細胞反應， 對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用。同時， 這種肽－ＤＮＡ 的復合成分在引發(fā)抗瘤免疫反應的過程中具有協(xié)同效應。,B,超抗原疫苗,超抗原是近年發(fā)現并研究證實在惡性腫瘤治療方面具有良好應用前景的免疫分子。它無需ＡＰＣ加工即可與ＭＨＣ分子結合，激活所有攜帶特殊Ｔ細胞受體片段的Ｔ細胞， 激活Ｔ細胞的克隆數大約是普通抗原的 1000 倍,對靶細胞產生強烈的殺傷作用。目前研究較多的超抗原主要是金黃色葡萄

53、球菌腸毒素 ａ,C,抗獨特型抗體疫苗,腫瘤抗原的抗獨特型抗體具有模擬腫瘤抗原及免疫調節(jié)的雙重作用， 稱為抗原的內影像型， 能有效克服腫瘤的免疫逃避。抗抗獨特型抗體在不用任何載體蛋白及佐劑的協(xié)助下就能引發(fā)特異性的抗瘤免疫應答， 若將其與 ＧＭ－ＣＳＦ 等細胞因子或 ＤＣ 耦聯， 則誘發(fā)的免疫效應更強。,腫瘤疫苗前景,由于腫瘤發(fā)生發(fā)展的復雜性和多樣性， 腫瘤疫苗的理論研究與實際應用目前仍存在一定差距。但不管如何， 其設計理念與研究成果已顯

54、示出強大的生命力， 有望在抑制腫瘤生長、轉移和復發(fā)等方面取得突破。在提高腫瘤疫苗效能的研究中，增強疫苗的免疫原性、克服腫瘤的免疫逃避、誘導靶向的細胞免疫將成為核心問題。,五、DNA疫苗,,DNA疫苗的概念,又稱基因疫苗或核酸疫苗是一種細菌的質粒，在克隆了特異性的基因以后，能在真核細胞中表達蛋白質抗原，刺激機體產生特異的體液和細胞免疫反應，尤其是能誘導產生具細胞毒殺傷性功能的T淋巴細胞，對病毒、細胞內寄生的細菌和寄生蟲所引起的傳染病可

55、能具有治療性效果和重要的預防作用。,DNA疫苗的發(fā)現,追溯到20世紀90年代的初期，當時有一些從事基因治療的科學家們用可在體內表達基因產物的核酸來做基因治療的試驗兩個令人欣喜的結果:流感DNA疫苗在小鼠動物實驗中顯示的對不同型別毒株攻擊的交叉免疫保護作用使得有希望解決流感疫苗長期以來面臨的因為流行株表面抗原變異而使疫苗無效的被動局面。乙型肝炎DNA疫苗可以刺激動物的免疫系統(tǒng)而產生抗乙型肝炎表面抗原的特異性抗體，但更重要的是DNA疫

56、苗能夠消除轉基因動物體內的乙型肝炎表面抗原門。,,,DNA疫苗的作用機理,DNA疫苗能像病毒的活疫苗一樣，進入宿主細胞的細胞核中轉錄為信使RNA，再在細胞漿中翻譯成蛋白質。其中一部分蛋白質在降解后與MHC的Ⅰ類分子結合；而另一部分蛋白質也可以分泌出去，再像外源蛋白質一樣被APC攝取后，在吞噬溶酶體中降解成的多肽和MHC的Ⅱ類分子結合(圖7.3)。所以DNA疫苗既能誘導細胞免疫，又能刺激產生體液免疫。,DNA疫苗誘導免疫反應的原理 (1

57、)肌細胞的直接參與,攝取了DNA的肌細胞可直接對表達的蛋白質抗原進行加工、處理和呈遞。DNA疫苗在肌細胞內表達蛋白質抗原，然后被細胞內的水解酶降解成8-12個氨基酸的短肽，它們和MHC的Ⅰ類分子結合，并呈遞到細胞表面被CD8 T細胞的受體識別而誘發(fā)免疫反應。,以樹突狀細胞為主的抗原呈遞細胞，即采源于骨髓的APC也可被DNA轉染。DNA疫苗在APC中表達抗原，蛋白質被水解酶降解成多肽后與MHC的Ⅰ類分子結合，再呈遞給CD8 T細胞而導致體

58、內CTL的免疫應答。另外，肌細胞在攝取DNA以后，DNA疫苗的基因在質粒所攜帶的強啟動子的作用下，在肌細胞內表達相應的蛋白質抗原。此時的肌細胞不能自己加工處理抗原，而是將蛋白質抗原釋放出去，然后被來源于骨髓的APC捕捉和攝取。,DNA疫苗誘導免疫反應的原理 (2)以樹突狀細胞為主的抗原呈遞細胞,都能攝取DNA ，并能對表達的蛋白質抗原進行加工和處理，降解后的多肽與MHC的Ⅰ類分子結合，并呈遞給CD8 T細胞而產生CTL的免疫應答。,

59、DNA疫苗誘導免疫反應的原理 (3)肌細胞和APC共同參與,DNA疫苗在APC內表達的蛋白質抗原可以有3種形式：,分泌型、細胞膜結合型和胞內型。表達分泌型蛋白質抗原的DNA疫苗誘導體液免疫反應的能力最強；而表達胞內型蛋白質抗原的DNA疫苗誘導CTL反應的能力最強。最近的實驗結果證明，在初次接種DNA疫苗的基礎上，如果加強接種的仍然是在細胞內表達的特異性抗原，那么CTL的反應強度可提高10～30倍；但是如果加強接種的是完整的可溶性蛋

60、白質抗原，那么產生的免疫反應將是以抗體為主的體液免疫反應。,DNA疫苗的載體,本質上是一種細菌的質粒，含有多重限制性內切酶的位點真核細胞啟動子 CpG核苷酸基序 用于選擇的標記 載體的復制基因,,,,基因槍轟擊,即將DNA分子包裹在金顆粒外面，然后在高壓槍的作用下對皮膚進行轟擊，金顆?？蓪NA分子帶人真皮層組織而誘導出和肌肉注射相當的免疫反應。優(yōu)點是DNA的劑量很小，只需要lμg的DNA，即肌肉注射劑量的1％。體液免疫反應