畢赤酵母菌表達(dá)重組豹蛙抗瘤酶(rrONC)及其生物學(xué)作用分析.pdf

1、豹蛙酶的核糖核酸酶活性低，細(xì)胞毒性強(qiáng)，對(duì)體內(nèi)外多種腫瘤有很強(qiáng)的殺傷作用，是當(dāng)前全球重點(diǎn)研究的100種新藥之一。為此，本文構(gòu)建了pPIC9K-rrONC表達(dá)載體，用畢赤酵母GS115為受體菌，從重組酵母菌中篩選出能正確表達(dá)重組豹蛙抗瘤酶(rrONC)的工程菌株，然后對(duì)該工程菌的搖瓶發(fā)酵條件、產(chǎn)物分離純化方法以及rrONC體外生物學(xué)作用進(jìn)行了研究。
　　本文在構(gòu)建工程菌時(shí)采用了適合該菌株的分泌型表達(dá)載體pPIC9K，并成功構(gòu)建了重組表

2、達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-rrONC。該質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化整合至畢赤酵母GS115的基因組中，再經(jīng)過(guò)基因組PCR篩選，MM和MD平板篩選，BMGY/BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)，SDS-PAGE鑒定等步驟檢測(cè)，最終獲得了可以正確表達(dá)rrONC的工程菌株。然后進(jìn)一步在搖瓶條件下，對(duì)其表達(dá)量與時(shí)間關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，該蛋白的表達(dá)量呈正態(tài)曲線，并在120h達(dá)到高峰。
　　本文用BMGY/BMMY培養(yǎng)基，對(duì)工程菌在1L搖瓶中的各種發(fā)酵條件進(jìn)行

3、了優(yōu)化摸索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1L搖瓶中工程菌表達(dá)重組豹蛙酶的最佳條件是菌液體積100ml，轉(zhuǎn)速200rpm，pH5.5，溫度25℃，甲醇濃度1％，硫酸銨濃度0.5％以及磷酸鹽濃度100mM。
　　本文摸索了分離純化rrONC的條件，結(jié)果表明，運(yùn)用等電點(diǎn)沉淀、低溫乙醇分級(jí)沉淀以及超濾依此對(duì)rrONC的搖瓶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，可獲得純度90％左右的目的產(chǎn)物。
　　本文初步檢測(cè)了rrONC對(duì)羊膜細(xì)胞WISH和九種癌細(xì)胞的體外生物學(xué)活性