雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)

1、第一節(jié)第一節(jié)雞胚接種雞胚接種一、雞胚的結(jié)構(gòu)雞胚是正在發(fā)育的活的機(jī)體，組織分化程度低，細(xì)胞代謝旺盛，適于許多人類和動(dòng)物病毒的生長增殖，是常用的病毒分離培養(yǎng)方法之一（衣原體、立克次體的分離亦用雞胚）。目前，雞胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、皰疹病毒及腦炎病毒，尤其在禽類病毒的研究上應(yīng)用較多?？捎糜诓《镜姆蛛x、鑒定，抗原和疫苗制備，以及病毒性質(zhì)的研究等。雖然隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，不少病毒已不再用雞胚來分離培養(yǎng)，但對(duì)某些病毒來說，雞胚仍是

2、一種不可缺少的培養(yǎng)手段。雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是，來源充足，價(jià)格低廉，操作簡單，無需特殊設(shè)備或條件，易感病毒譜較廣，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體等。當(dāng)然，雞胚培養(yǎng)也有其缺點(diǎn)，即除痘斑和雞胚死亡是特異性感染指征外，多需用第二試驗(yàn)系統(tǒng)來測定病毒存在與否；非SPF雞胚，亦可能含有對(duì)某些家禽病毒的母源抗體，甚至還可能帶有雞白痢沙門氏菌、霉形體、雞白血病等病毒。因此，用雞胚分離培養(yǎng)病毒時(shí)，必須考慮這些問題。原則上應(yīng)使用非免疫蛋來孵雞胚，最好用SPF雞胚。一般說

3、來，孵育至814天的雞胚最有利于病毒的生長，因?yàn)榇穗A段雞胚發(fā)育日趨完善，各種臟器均已形成，已能經(jīng)受接種物的適當(dāng)刺激，同時(shí)胚胎細(xì)胞幼嫩，骨胳不健全，還未長出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同時(shí)也有利于收獲高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛漸生，已不便感染病毒，特別是已不利于收獲病毒材料。在操作雞胚時(shí)）一定要注意到這一點(diǎn)。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黃陷入胚胎腹部，另一部分則仍留在體外，胚胎已發(fā)育

4、成小雞，破殼而出。雞胚的基本結(jié)構(gòu)如圖，從圖中可以看出，雞胚的最外層為石灰質(zhì)的卵殼，上有氣孔供氣體交換，卵殼之下為殼膜，很易與卵殼分離，其功能是使氣體分子與胚胎內(nèi)的液體分子在內(nèi)外進(jìn)行交換，因此在孵育時(shí)需要有一定的濕度和空氣。如果濕度太低，雞胚就容易脫水、引起雞胚死亡。氣流不通，雞胚缺氧，同樣會(huì)造成雞胚死亡。雞胚的鈍頭（俗稱“大頭”），是氣室，其功能是呼吸和調(diào)節(jié)胚內(nèi)壓力。殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，其外層為絨毛膜，系外胚層形成，內(nèi)層為尿

5、囊膜，系內(nèi)胚層形成，兩膜所夾為中胚層。由于胚胎的肺發(fā)育不完善，此時(shí)絨毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，氣體的交換是在絨毛尿囊膜的血管內(nèi)通過卵殼進(jìn)行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，內(nèi)含的尿囊液初為透明液體，成分極類似于生理鹽水溶液，以后則尿酸鹽含量增高。尿囊液量在1113日齡時(shí)最高，平均達(dá)6毫升左右。羊膜是胚胎的最內(nèi)層包被，系外胚層和中胚層形成，羊膜腔內(nèi)含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是單純的生理鹽水溶液，以后蛋白質(zhì)含量增加。羊水量在815日齡

6、時(shí)最高，平均約為1毫升左右。附著于胚胎上的是卵黃囊，其膜系由內(nèi)胚層和中胚層形成，內(nèi)包卵黃，是胚胎發(fā)育的養(yǎng)料。卵的尖端（俗稱“小天孵育后，未受精卵不見有雞胚跡象，僅見模糊的卵黃暗影；受精卵則可見清晰的血管小團(tuán)，其中有雞胚跡象，較大的雞胚可見到胚胎主動(dòng)運(yùn)動(dòng)瀕死或死亡的雞胚則見到胚胎運(yùn)動(dòng)呆滯或不運(yùn)動(dòng)，血管昏暗、折斷或漂落，這種雞胚應(yīng)剔出不用。四、雞胚的接種1.絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖，這些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上形成

7、痘斑和病斑。此外其它用于絨毛尿囊腔接種的病毒也可使用，而且收毒量更高，缺點(diǎn)是操作不易成功。選取1013日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，并在胚位附近無大血管處，劃一記號(hào)，用蛋鉆在卵殼上磨一裂縫（或用電烙器在卵殼上烙出一個(gè)直徑為23mm的烤焦圈），小心將蛋殼去掉，注意切勿損傷殼膜；在氣室中央也鉆一個(gè)小口，用針尖挑破殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜，滴加1滴無菌生理鹽水于刺破處，用吸耳球緊貼氣室中央小口，造成負(fù)壓，即可見生理鹽水下沉，絨

8、毛尿囊膜凹下，和殼膜分開，造成人工氣室。滴加0.050.1ml接種物于絨毛尿囊膜上，臘封口，封口部位朝上，不要翻動(dòng)，37℃培養(yǎng)。2.尿囊腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分離和增殖，馬腦炎病毒也常用、IBD、IBDV也可。選取911日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，在氣室邊緣上打一小口，避開大血管處，注射器沿小口插入11.5cm，注入接種物0.10.2ml，臘封口。3.卵黃囊接種主要用于蟲媒批膜病毒以及

9、鸚鵡熱衣原體和立克次氏體的分離和增殖。選取68日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出；垂直放置在卵座上，在氣室中央鉆一個(gè)小口，注射器沿小口插入3cm，注入接種物0.10.5ml，臘封口。4.羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖，操作技術(shù)比較困難。A.開窗法：從氣室處去蛋殼開窗，從窗口用小鑷子剝開蛋膜，一手用平頭鑷子夾住羊膜腔向上提，另一手注射0.050.1ml接種物于腔內(nèi)，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受傷而死，而且易污染