雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)

1、第一節(jié)第一節(jié)雞胚接種雞胚接種一、雞胚的結構雞胚是正在發(fā)育的活的機體，組織分化程度低，細胞代謝旺盛，適于許多人類和動物病毒的生長增殖，是常用的病毒分離培養(yǎng)方法之一（衣原體、立克次體的分離亦用雞胚）。目前，雞胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、皰疹病毒及腦炎病毒，尤其在禽類病毒的研究上應用較多。可用于病毒的分離、鑒定，抗原和疫苗制備，以及病毒性質的研究等。雖然隨著組織培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展，不少病毒已不再用雞胚來分離培養(yǎng)，但對某些病毒來說，雞胚仍是

2、一種不可缺少的培養(yǎng)手段。雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點是，來源充足，價格低廉，操作簡單，無需特殊設備或條件，易感病毒譜較廣，對接種的病毒不產生抗體等。當然，雞胚培養(yǎng)也有其缺點，即除痘斑和雞胚死亡是特異性感染指征外，多需用第二試驗系統(tǒng)來測定病毒存在與否；非SPF雞胚，亦可能含有對某些家禽病毒的母源抗體，甚至還可能帶有雞白痢沙門氏菌、霉形體、雞白血病等病毒。因此，用雞胚分離培養(yǎng)病毒時，必須考慮這些問題。原則上應使用非免疫蛋來孵雞胚，最好用SPF雞胚。一般說

3、來，孵育至814天的雞胚最有利于病毒的生長，因為此階段雞胚發(fā)育日趨完善，各種臟器均已形成，已能經受接種物的適當刺激，同時胚胎細胞幼嫩，骨胳不健全，還未長出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同時也有利于收獲高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛漸生，已不便感染病毒，特別是已不利于收獲病毒材料。在操作雞胚時）一定要注意到這一點。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黃陷入胚胎腹部，另一部分則仍留在體外，胚胎已發(fā)育

4、成小雞，破殼而出。雞胚的基本結構如圖，從圖中可以看出，雞胚的最外層為石灰質的卵殼，上有氣孔供氣體交換，卵殼之下為殼膜，很易與卵殼分離，其功能是使氣體分子與胚胎內的液體分子在內外進行交換，因此在孵育時需要有一定的濕度和空氣。如果濕度太低，雞胚就容易脫水、引起雞胚死亡。氣流不通，雞胚缺氧，同樣會造成雞胚死亡。雞胚的鈍頭（俗稱“大頭”），是氣室，其功能是呼吸和調節(jié)胚內壓力。殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，其外層為絨毛膜，系外胚層形成，內層為尿

5、囊膜，系內胚層形成，兩膜所夾為中胚層。由于胚胎的肺發(fā)育不完善，此時絨毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，氣體的交換是在絨毛尿囊膜的血管內通過卵殼進行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，內含的尿囊液初為透明液體，成分極類似于生理鹽水溶液，以后則尿酸鹽含量增高。尿囊液量在1113日齡時最高，平均達6毫升左右。羊膜是胚胎的最內層包被，系外胚層和中胚層形成，羊膜腔內含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是單純的生理鹽水溶液，以后蛋白質含量增加。羊水量在815日齡

6、時最高，平均約為1毫升左右。附著于胚胎上的是卵黃囊，其膜系由內胚層和中胚層形成，內包卵黃，是胚胎發(fā)育的養(yǎng)料。卵的尖端（俗稱“小天孵育后，未受精卵不見有雞胚跡象，僅見模糊的卵黃暗影；受精卵則可見清晰的血管小團，其中有雞胚跡象，較大的雞胚可見到胚胎主動運動瀕死或死亡的雞胚則見到胚胎運動呆滯或不運動，血管昏暗、折斷或漂落，這種雞胚應剔出不用。四、雞胚的接種1.絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖，這些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上形成

7、痘斑和病斑。此外其它用于絨毛尿囊腔接種的病毒也可使用，而且收毒量更高，缺點是操作不易成功。選取1013日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，并在胚位附近無大血管處，劃一記號，用蛋鉆在卵殼上磨一裂縫（或用電烙器在卵殼上烙出一個直徑為23mm的烤焦圈），小心將蛋殼去掉，注意切勿損傷殼膜；在氣室中央也鉆一個小口，用針尖挑破殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜，滴加1滴無菌生理鹽水于刺破處，用吸耳球緊貼氣室中央小口，造成負壓，即可見生理鹽水下沉，絨

8、毛尿囊膜凹下，和殼膜分開，造成人工氣室。滴加0.050.1ml接種物于絨毛尿囊膜上，臘封口，封口部位朝上，不要翻動，37℃培養(yǎng)。2.尿囊腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分離和增殖，馬腦炎病毒也常用、IBD、IBDV也可。選取911日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，在氣室邊緣上打一小口，避開大血管處，注射器沿小口插入11.5cm，注入接種物0.10.2ml，臘封口。3.卵黃囊接種主要用于蟲媒批膜病毒以及

9、鸚鵡熱衣原體和立克次氏體的分離和增殖。選取68日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出；垂直放置在卵座上，在氣室中央鉆一個小口，注射器沿小口插入3cm，注入接種物0.10.5ml，臘封口。4.羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖，操作技術比較困難。A.開窗法：從氣室處去蛋殼開窗，從窗口用小鑷子剝開蛋膜，一手用平頭鑷子夾住羊膜腔向上提，另一手注射0.050.1ml接種物于腔內，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受傷而死，而且易污染