實(shí)時(shí)rt-pcr1

1、1實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系（重慶400016）舒朝忠羅進(jìn)勇綜述尹一兵康格非審校[摘要]：實(shí)時(shí)RTPCR是一種新技術(shù)，它利用熒光實(shí)時(shí)檢測PCR反應(yīng)，靈敏度高、特異性好、節(jié)約時(shí)間。本文對(duì)分子燈塔、DNA結(jié)合染色、雜交探針和水解探針?biāo)姆N方法的原理、特點(diǎn)作了簡要的介紹。并比較了三種可供選擇的儀器，即ABIPrism7700、Lightcycler和BiadiCycler各自的特點(diǎn)。使用特定的儀器、選擇不同的實(shí)時(shí)RT

2、PCR策略，可以將實(shí)時(shí)RTPCR應(yīng)用于絕對(duì)定量、檢測點(diǎn)突變和等位基因和mRNA結(jié)合變量，并可通過優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)多重RTPCR。關(guān)鍵詞：逆轉(zhuǎn)錄PCR定量探針對(duì)于檢測來自有限組織標(biāo)本中低含量mRNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranionpolymerasechainreaction，RTPCR)是一種敏感的方法。但是，RTPCR在重復(fù)性和特異性方面還存在一些問題。最近發(fā)展起來的以熒光定量為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(realtimerev

3、ersetranionpolymerasechainreaction)，是對(duì)RTPCR的極大改進(jìn)和優(yōu)化，它不僅最大限度地克服了RTPCR的一些缺點(diǎn)，還具有自身突出的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)。因此，其應(yīng)用前景十分廣闊。本綜述討論實(shí)時(shí)RTPCR的所涉及的幾個(gè)重要方面，對(duì)比常規(guī)RTPCR和實(shí)時(shí)RTPCR，介紹實(shí)時(shí)PCR策略，推薦幾種可進(jìn)行實(shí)時(shí)RTPCR的儀器，并簡介實(shí)時(shí)RTPCR的應(yīng)用。一、實(shí)時(shí)RTPCR的特點(diǎn)：實(shí)時(shí)RTPCR是將熒光技術(shù)應(yīng)用于RTPCR，

4、即使用熒光染料或熒光標(biāo)記的探針，與PCR過程中的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，在PCR的每一次循環(huán)中，都可觀察到熒光強(qiáng)度的變化，這種變化對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終可得到反應(yīng)初期的靶基因數(shù)量。實(shí)時(shí)RTPCR用特定的儀器將RTPCR的擴(kuò)增、檢測和結(jié)果分析結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的實(shí)時(shí)絕對(duì)定量，相比于常規(guī)RTPCR，實(shí)時(shí)RTPCR具有以下特點(diǎn)：1.實(shí)時(shí)測定、節(jié)約時(shí)間常規(guī)RTPCR在PCR反應(yīng)后，常需要使用凝膠電泳、DNA測序、Sout

5、herblot等方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工或自動(dòng)化定量，這些后續(xù)步驟不僅使測定時(shí)間變長，而且在樣品的傳遞過程中還增加了污染的機(jī)會(huì)，而實(shí)時(shí)RTPCR不需要擴(kuò)增后的這些處理就可直接對(duì)待測樣本實(shí)時(shí)定量，同時(shí)，從逆轉(zhuǎn)錄開始到完整定量結(jié)束整個(gè)過程，都可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，這極大地節(jié)約了時(shí)間和勞動(dòng)力。2.重復(fù)性好、測定偏差小RTPCR的重復(fù)性可用循環(huán)閾值來衡量，循環(huán)閾值的定義是：在實(shí)時(shí)RTPCR過程中，連續(xù)不斷地監(jiān)測反映體系中熒光信號(hào)的變化，當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值（

6、根據(jù)熒光信號(hào)基線的平均值和平均標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出以99.7%的置信度大于平均值的熒光值，即為閾值）時(shí)，此時(shí)的循環(huán)次數(shù)即為循環(huán)閾值。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR循環(huán)閾值的變異系數(shù)在2%以下，而常規(guī)RTPCR變異系數(shù)多在14%左右。毫無疑問實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR比常規(guī)RTPCR的測定偏差明顯減小。3.靈敏度高、特異性好3計(jì)增添了靈活性。4.水解探針?biāo)馓结樂椒ɡ肈NA多聚酶的5’核酸外切酶活性來水解與目的序列雜交的探針，通常使用的是Taq或Tth聚合酶，但實(shí)際

7、上任何具有5’核酸外切酶活性的酶均可使用[4]。先設(shè)計(jì)一個(gè)可與目的序列特異性雜交的單鏈探針，長度為20～30bp此探針的的5’端含有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，其發(fā)射的熒光可被探針3’端的熒光抑制基團(tuán)吸收或抑制，探針的3端已被封閉，不具有延伸能力。在沒有與探針互補(bǔ)的目的序列存在時(shí)，探針保持游離，由于Taq或Tth聚合酶的5’核酸外切酶活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針仍保持完整熒光信號(hào)不改變。當(dāng)有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)時(shí)，探針在PCR的變性階段可與其

8、雜交，雜交位點(diǎn)一般在擴(kuò)增序列的中部，聚合酶引導(dǎo)引物延伸，當(dāng)?shù)竭_(dá)探針雜交位點(diǎn)時(shí)，將探針從序列上替換下來，同時(shí)聚合酶發(fā)揮5’核酸外切酶活性水解探針，把探針5’端的熒光染料切割下來（切口平移效應(yīng)），使熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光抑制基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光，熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)于上次循環(huán)末期或本次循環(huán)初期所存在的擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。有三個(gè)參數(shù)可影響水解探針法，即完整探針的淬滅、探針的雜交效率和聚合酶的切割效率。三、儀器目前市面上有三種儀器可實(shí)現(xiàn)對(duì)RTPCR的實(shí)時(shí)監(jiān)測

9、，所有儀器都使用封閉的試管系統(tǒng)進(jìn)行操作，不需擴(kuò)增后的處理即可定量，這避免了污染問題，并節(jié)約了時(shí)間。所有儀器從逆轉(zhuǎn)錄到完整定量，都實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，使得它們很適合于大量樣本的篩選。ABIPrism7700有一個(gè)固定的熱循環(huán)儀（96孔），它能檢測500～600nm的熒光。通過光纖的多元排列，將激發(fā)光分配到微孔反應(yīng)管中，激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光再通過光纖傳遞回去，直接進(jìn)入帶有電荷偶聯(lián)裝置（gecoupleddeviceCCD）照相機(jī)的色譜儀，進(jìn)行光譜結(jié)

10、果分析。Lightcycler在小體積的玻璃毛細(xì)管中進(jìn)行RTPCR，這種毛細(xì)管位于一個(gè)類似轉(zhuǎn)子的傳送帶上，傳送帶運(yùn)送毛細(xì)管到一個(gè)發(fā)射藍(lán)光的二極管（激發(fā)波長為470nm），激發(fā)產(chǎn)生熒光，熒光可被三個(gè)光電探測二極管讀取，每個(gè)光電探測二極管具有不同的濾波長度，分別為530、640和710nm，使得可以使用不同光譜特性的熒光探針。Lightcycler可監(jiān)測PCR反應(yīng)的每一次循環(huán)，是真正的實(shí)時(shí)測定。BiadiCycler是最近才投放市場的，它的

11、特點(diǎn)是：有一個(gè)可改變波長的激發(fā)光源，具有比ABIPrism7700和Lightcycler更寬的熒光檢測范圍，可達(dá)到400～700nm；不像ABIPrism7700對(duì)樣本順序掃描，BiadiCycler可同時(shí)掃描96個(gè)樣本，掃描頻率可自行設(shè)定；可同時(shí)檢測四種不同顏色的熒光，更加適合于多元分析；可用于各種實(shí)時(shí)RTPCR定量策略，在反應(yīng)進(jìn)程中隨時(shí)可分析樣本數(shù)據(jù)。因此，BiadiCycler比ABIPrism7700和Lightcycler在

12、反應(yīng)設(shè)計(jì)上更具靈活性。四、實(shí)時(shí)RTPCR的應(yīng)用1.直接定量使用實(shí)時(shí)RTPCR可對(duì)待測樣本中的RNA進(jìn)行絕對(duì)定量，其定量原理是實(shí)時(shí)RTPCR的門檻循環(huán)與反應(yīng)體系中的初始模板數(shù)量（即樣本中的待測基因數(shù)量）的對(duì)數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系，利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，在的到樣本的Ct值后，可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)直線回歸計(jì)算出待測樣本的初始拷貝數(shù)。直接定量通過分子燈塔、DNA結(jié)合染色、雜交探針和水解探針均可實(shí)現(xiàn)。這幾種方法已被應(yīng)用在許多定量