基因檢測技術的類型及臨床應用培訓課件

1、基因檢測技術的類型與臨床應用,醫(yī)學遺傳學服務的特殊性,先證者診斷家庭成員檢測遺傳病治療遺傳咨詢遺傳病預防二級預防產前診斷三級預防宗旨：為家庭謀福祉,不僅關系著先證者還牽連著家庭、家族產前診斷一步錯步步錯生命所系如臨深淵、如履薄冰,遺傳病的復雜性,疾病種類繁多，~7000+種，不斷增加涉及各個臨床分科，就醫(yī)困難遺傳異質性，精準的核心難題新學科，教育準備不足醫(yī)療資源分配差強人意共同努力,4,人類基因突變

2、分類,單堿基置換缺失和插入重復倒位拷貝數(shù)變異動態(tài)突變基因轉換（gene conversion）復雜基因組重排：插入-缺失（Indels）甲基化異常（包括表觀遺傳學）,5,基因變異種類和大小,基因檢測,,,,現(xiàn)有的遺傳檢測的技術,常規(guī)檢驗影像學遺傳學技術細胞遺傳學核型分析分子細胞遺傳學FISHaCGHSNP array生化遺傳學質譜、色譜、串聯(lián)-質譜酶活性測定分子遺傳學基因組變異aCGHSNP

3、a單基因變異PCR-電泳PCR-雜交........測序Sanger測序NGS（下一代測序）,遺傳檢測≠測序測序≠NGS,分子遺傳檢測技術,基于分子雜交Southern印跡雜交寡核苷酸探針雜交(ASO)ASO反向斑點雜交（RDB)SNP DNA 芯片多重連接探針擴增(MLPA) FISH 陣列比較基因組雜交(Array CGH) BoBs基于PCR 、電泳擴增長度分析STR多態(tài)性連鎖分析動態(tài)突變

4、多重PCRGapPCR等位基因特異性PCR（AS-PCR）逆轉錄PCR（RT-PCR） PCR產物酶切,基于構象分析單鏈構象多態(tài)性(SSCP) 高效液相色譜(DHPLC)多色探針熔解曲線分析（MMCA）定量分析real time PCRMLPAaCGHSNPa測序Sanger 測序NGS（二代測序）序列測定算法改進（拷貝數(shù)）大片段缺失/重復檢測（CNV-Seq),基因檢測,PCR,提示：此圖為動畫，等

5、待“END”出現(xiàn)后再點擊,最簡單的應用：檢測有無,1.Marker-DL10002.正常男性對照3.正常女性對照4.空白對照5.待測標本-M15846.待測標本-M15947.待測標本-M1605,DNA測序,ddATP,自動化DNA測序,,Big Dye,自動化測序結果,大尺度變異的檢測方法,傳統(tǒng)的染色體核型分析，檢測染色體數(shù)目和大結構異常一般分別率：G350、G400高分辨：G500、G800原位雜交，檢測已知位置

6、的缺失或插入放射性熒光標記（FISH）染色體特異探針區(qū)帶特異探針（包括著絲粒探針、端粒探針）基因特異探針間期核FISH染色體微缺失分析（CMA），檢測精度較高按檢測方法分比較基因組雜交（CGH）：DNA片段芯片探針（aCGH）（DNA克隆、cDNA克隆、合成探針按載體分中期染色體體芯片SNP 芯片（單核苷酸特異探針，引物延伸）（SNP array）,aCGH,Illumina (GoldeGateTM),aCG

7、H與SNPa比較,什么情況下委托CMA,國際細胞基因組芯片標準協(xié)作組(International Standards for Cytogenomic Arrays Consortium，ISCAC) 2010年研究了21698例智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形以及自閉癥患者，發(fā)現(xiàn)染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA) 技術對致病性CNVs的檢出率為15-20%，比傳統(tǒng)G顯帶核型分析技術的檢

8、出率（3%）高很多。ISCAC推薦將CMA替代染色體核型技術作為對原因不明的發(fā)育遲緩、智力低下、自閉癥以及多種體征畸形患者的臨床一線檢測方法,Miller DT, Adam MP, Aradhya S, et al. Consensus statement：chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with devel

9、opmental disabilities or congenital anomalies [J]. Am J Hum Genet, 2010, 86(5): 749-764.,18,外顯子缺失：多重PCR,,,南京江蘇省人民醫(yī)院生殖遺傳檢測中心,多態(tài)性分析檢測缺失,雙側雙重AS-PCR與PCR-酶切：SMN1 e7純合性缺失,母源污染的致命性差錯！！,李曉僑 姚鳳霞 蘇亮 ，等.一種簡化的檢測SMN1基因純合性缺失的方法。醫(yī)學研究雜

10、志 2009；38（5）：29-32,21,缺失區(qū)域多態(tài)性位點分析,Williams 綜合征,,,,,多重連接探針擴增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA）,,,拷貝數(shù)檢測,MLPA結果分析,DMD,,MLPA結果的一般顯示,直觀的結果顯示,,DMD,重復/插入(包括CNV)檢測方案,小片段PCR產物直接電泳（二重）PCR產物Sanger直接測序大片段So

11、uthern印跡實時（定量）PCR長片段PCR、Gap-PCRMLPAFISH芯片aCGHSNP arrayBoBsNGSCNV-Seq序列測定數(shù)據（新算法）,重復,D464: P034: e3-10dup,,P035: e11-18dup,,DMD,動態(tài)突變,Southern印跡PCRGC-rich長片段PCR產物電泳重復序列探針雜交FQ-二重PCR，電泳TP-PCR（例如重復序列特異內引物介導的“多

12、頻段” PCR——AmplideX FMR1），電泳,29,Fq-PCR分析動態(tài)突變,定量分析,,SCA3,,30,Trip—PCR：AmplideX FMR1,http://www.clinchem.org/cgi/doi/10.1373/clinchem.2009.136101,“多頻段PCR”,PWS/AS檢測,15q11-13區(qū)域父源基因缺失，母源基因甲基化 PWS。,,甲基化分析（Hha I酶切）,缺失,小尺度突變的檢

13、測方法,點突變檢測缺失檢測重復/插入檢測動態(tài)突變檢測倒位檢測轉換突變檢測甲基化檢測,基因檢測,點突變檢測方案,單一基因突變檢測，PCR+Sanger測序，RDB、MMCA優(yōu)先突變類型檢測優(yōu)先突變區(qū)域檢測常染色體基因突變等位基因檢測遺漏的可能錯義或同義的致病性判斷大片段缺失引物區(qū)模板缺失引物不應Primer-SNP未覆蓋區(qū)域啟動子區(qū)域的突變內含子中影響mRNA加工的突變UTR區(qū)域突變遙遠調控區(qū)的突變

14、遺傳異質性疾病主要基因分層突變檢測（同上）高通量NGS疾病組（癥狀群）多個候選基因的外顯子捕獲測序全基因組測序,積累經驗，隨時調整,基因檢測,等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）,在嚴格的雜交洗脫溫度下，只要有一個堿基不匹配，正常探針只能與正?；蛐蛄须s交。通常為兩份，一份與正?；蛐蛄须s交，一份與突變序列雜交。通過控制洗脫溫度，使正常探針只能與正常基因雜交而不與突變序列雜交，反之亦然。,基于分子雜交,,C,,A,寡核苷酸探

15、針（ASO) 檢測PAH點突變,基于分子雜交,ASO反向雜交(RDB)檢測β地貧,未知突變的檢測,測序Sanger：應用于臨床診斷明確MLPA、SNParray補充NGS篩查：應用于遺傳異質性高、基因龐大Sanger測序驗證傳遞分析,測序提示基因缺失,下一代測序（NGS）,分子生物學基因組DNA的片段化及建庫平行擴增及測序數(shù)據拾取及組裝生物信息學數(shù)據質量的評價SNV、微小缺失列表遺傳學變異的篩選傳遞分析醫(yī)學

16、遺傳學臨床解讀,二代測序,二代測序數(shù)據示意圖,基因捕獲測序結果：基因突變,突變,X染色體基因缺失/重復,44,測序技術的遺漏（ADO）：捕獲不全及PCR不應,缺失的真?zhèn)蜳CR測序時，等位基因遺漏,,,,X,,X,,,,二代測序技術的評價,長處高通量將一本書拆開來，多人同時讀眾多基因，遺傳異質性疾病，一攬子解決多個個體，末端標簽（降低成本）（醫(yī)生）臨床診斷的精度要求低（市場宣傳的誘人之處）,短處海量信息的篩選難度捕獲不

17、全遺漏集成不完善，Panel構成不全并不能“一網打盡”缺失/重復內含子、調控區(qū)域、UTR不覆蓋測序深度點突變的誤差（擬基因的干擾？）普及性價格解度,1.數(shù)據庫的支持2.Sanger驗證3.冷靜選擇，謹慎解讀,適宜技術：不求最高，但求最準,強調一點：遺傳異質性,基因座異質性：相同的臨床癥狀（疾病）由不同的基因引起耳聾，有100多個基因座白內障，有20多個基因座脊髓小腦共濟失調，有10多個基因座痙攣性截癱，有

18、30多個基因座高苯丙氨酸血癥型：苯丙酮尿癥（一個基因）、BH4缺乏癥（有4個基因）成骨不全，有17個亞型，15個基因座等位基因異質性：同一基因的不同等位基因所導致的臨床癥狀不同。例如：珠蛋白基因,遺傳異質性：成骨不全的致病基因,,,醫(yī)生的視野,醫(yī)學遺傳學家的視角,醫(yī)生是實驗室的眼睛，實驗室是醫(yī)生的眼鏡、放大鏡、顯微鏡沒有臨床表型，實驗室無法致病基因,遺傳異質性：新生兒篩查：PKU（實際是HPA）,病因分類：苯丙氨酸羥化酶（

19、PAH）缺乏典型PKU：Phe≥1200?mol/L(≥20mg/dl)輕型PKU：Phe360-1200?mol/L(6-20mg/dl)HPA: Phe<360?mol/L(<6mg/dl)四氫生物蝶呤（BH4）缺乏癥6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶(PTPS)缺乏二氫蝶啶還原酶(DHPR)缺乏三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶(GTPCH)缺乏蝶呤-4 α -二甲醇胺脫水酶(PCD)缺乏,按對BH4反應性分類： BH4反應

20、型： BH4缺乏癥PAH缺乏癥BH4無反應型PAH缺乏癥,必須鑒別診斷，事關治療與產前診斷,遺傳檢測的申請,單基因病先證者診斷，盡量診斷明確單個基因突變分析對醫(yī)生要求高遺傳異質性強或診斷不明確醫(yī)生可以根據病種（癥狀）下單（打包）二代測序需要Sanger驗證要求解釋明確不要被忽悠,盡量描述臨床背景遺傳檢測為“管中窺豹”醫(yī)生指那打那聯(lián)系臨床表現(xiàn)分析檢測結果父母的檢測問題需要進行傳遞分析避免漏檢避免錯誤結

21、論但DMD的母親不需要檢測PWS/AS的父母不要檢測因為隱秘傳遞的很少陰性結果可能引起誤解、誤導,檢測項目選擇,有的放矢點突變檢測已知突變檢測Sanger測序RBDMMCA未知突變的檢測Sanger測序拷貝數(shù)檢測多重PCR（缺失）Gap-PCR（缺失）MLPA（缺失、重復）Real-time PCR動態(tài)突變,撒大網CMASNPaAcghBoBaNGS外顯子較多的單一基因遺傳異質性癥狀包

22、全外顯子,遺傳檢測的材料,外周血抗凝血血片組織塊病理組織蠟塊切片穿刺液精液毛囊絨毛膜絨毛脫落上皮細胞口腔唾液拭子尿液羊水,分子診斷技術在臨床的應用,臨床擬診應盡量準確檢測方案的確定醫(yī)生是實驗室的眼睛，實驗室是“指哪打哪”NGS數(shù)據解讀解讀——數(shù)據與臨床表型的對接照妖鏡下妖魔盡現(xiàn)，但誰是真兇？因此，即使不能做出診斷，也要提供詳細的臨床描述檢測項目優(yōu)先選擇簡單穩(wěn)定的適宜技術，不求最好，只求準確

23、選擇NGS，要注意panel覆蓋率,采用適宜檢測方案,臨床背景：患兒出生一個月時發(fā)現(xiàn)左側“腹股溝包塊”，當?shù)蒯t(yī)院診斷為“疝氣”。B超提示“左側腹股溝可疑睪丸聲像”。染色體核型分析為46,XY。NGS檢測：AR基因外顯子1檢測到缺失突變，c.512delT(p.F171fs)?；蛟\斷：不完全型雄激素不敏感（PAIS）評論：應該根據臨床和核型分析，確定檢測方案，AR基因的Sanger測序應為首選。,NGS,臨床背景：患兒G2P2

24、，BW3300g，足月順產。智力運動落后，10個月會坐，現(xiàn)可扶走，會叫爸爸，納可，愛吃咸食，大便干，3天排便1次。精神反應可，咳嗽，痰多，肌力、肌張力可。MRI：雙側基底節(jié)損害。NGS結果：線粒體DNA突變：MT-ATPase6 mt.9176T>C 純質性改變。可導致Leigh綜合征或家族性雙側紋狀體壞死 與線粒體病相關的核基因：POLGc.500delG（母源）雜合突變，可導致線粒體DNA缺失綜合征（AR）或進行性眼外

25、肌麻痹（AD）評論：分步委托可避免無用功,NGS結果驗證,解決三個問題：確定是否真實存在可能是擬基因的干擾樣品是否錯了是否來自父母可能的是新突變顯性遺傳致病突變的確認兩個突變可能來自同一個親人NGS的結果只是數(shù)據，驗證之后才是個體的基因型樣品是否有錯,雜合子：[c.3230C>T,p.P1077L][c.4726C>T,p.R1576C]/,背景：耳聾和關節(jié)炎耳聾相關基因，101個,基因：TRIOBP,

26、NGS的應用需要多方面合作,分子生物學基因組DNA的片段化及建庫平行擴增及測序數(shù)據拾取及組裝生物信息學數(shù)據質量的評價遺傳學變異的篩選醫(yī)學遺傳學臨床解讀,基因檢測技術應用的挑戰(zhàn),科學問題要嚴謹大數(shù)據庫的搭建技術的規(guī)范化程序的規(guī)范化從營銷到售后服務強調遺傳咨詢科研要跟上技術的研發(fā)結果的臨床意義NGS檢出的AD、XR致病基因與臨床表型不吻合所引起的思考倫理學問題要慎重“能”與“該”對生命的敬畏隱私

27、報告的投送匿名化：數(shù)據庫和檢測報告第三方檢測中服務的提供公平競爭行業(yè)行為規(guī)范化,沒有一項技術是完美的,染色體、aCGH的分辨率大數(shù)據解讀缺乏判斷依據點突變致病性的判斷，HGMD或dbSNP的不足覆蓋度參數(shù)的考量捕獲不全，無論是Sanger還是NGSPrimer-SNP大片段缺失群體差異，數(shù)據使用，中國人數(shù)據缺乏個體差異，NIPT假陰性點與線，管中窺豹，可能有遺漏評價的技術上的困難檢材質量代表性（人體

28、是一個嵌合體）,未來應用的趨勢與挑戰(zhàn),攜帶者篩查，防患于未然游離核酸分析腫瘤早期診斷無創(chuàng)產前篩查、診斷單細胞分析自然妊娠，母血中胎兒細胞：無創(chuàng)產前診斷IVF，胚胎細胞：PGT、PGD大跨度分析單分子測序單染色體測序長片段PCR、純化（克隆測序）,基因突變的描述,以c、g、r、m、p、等5個小寫英語字母和縮略號‘.’指出是在哪種層面上描述的變異“c.” ：編碼DNA序列（coding DNA sequence）“g

29、.” ：基因組DNA（genomic DNA），以RefSeq為準“m.” ：線粒體DNA（mitochondrial DNA），已有編號“r.”： RNA，同c.“p.”：蛋白質（protein），以第一個密碼子（甲硫氨酸）為1C.編號始密碼子ATG中的A編號為‘1’ 5’UTR：‘-1’，‘-2’，… ；3’UTR：*1、*2，…；內含子5’端：外顯子最后1個核苷酸的編號‘+1’、‘+2’，…內含子3’端：外顯子最

30、后1個核苷酸的編號‘-1’、‘-2’，…,http://www.hgvs.org/mutnomen,變異類型的描述,DNA水平：①單核苷酸置換：以‘﹥’表示置換，之前為被置換的核苷酸，之后為置換后的核苷酸，分別以大寫英語字母A、T、G、C表示，如，G>T；② 缺失、插入、重復、轉換缺失：‘del’ （deletion）重復：‘dup’ （duplication）插入：‘ins’（insertion）倒位：‘inv’ （