麥麩酯酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、酯酶是能夠使酯鍵分解，生成酸和醇一系列酶的總稱。植物酯酶是植物不同部位、各個(gè)成長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞組成成分，是羧酸酯水解酶類一種。植物酯酶能夠使α-乙酸萘酯水解生成乙酸和α-萘酚，顯色劑與α-萘酚反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物。氨基甲酸酯類農(nóng)藥和有機(jī)磷類農(nóng)藥會(huì)抑制植物酯酶酶活力，因此通過植物酯酶酶活力的抑制程度判斷農(nóng)藥的殘留量。本研究以麥麩為植物酯酶的提取原料，對(duì)麥麩酯酶的分離及純化技術(shù)進(jìn)行了研究，并對(duì)純化后的麥麩酯酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。主要研究結(jié)果如下:<

2、br>　　1.選擇底物為a-乙酸萘酯，顯色劑為固蘭B鹽，考察吸收波長(zhǎng)、緩沖液pH、溫度、SDS濃度、底物濃度、顯色劑濃度及用量對(duì)麥麩酯酶單位酶活(U/mL)的影響，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定的麥麩酯酶的最佳酶活力測(cè)定條件為:緩沖液pH值7.2、底物a-乙酸萘酯濃度8×10-4mol/L、恒溫水浴溫度40℃，SDS濃度4.25％;單位酶活力達(dá)16194.35U/mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型值相符，證明應(yīng)用響應(yīng)面法所得到的麥麩酯酶酶活力測(cè)定工藝參數(shù)是可

3、行的。
　　2.以NaNO3-磷酸緩沖液為溶劑對(duì)麥麩酯酶進(jìn)行水浴靜置提取，分析提取液pH值、外加無機(jī)鹽種類及濃度、料液比、時(shí)間及溫度等提取因素對(duì)麥麩酯酶單位酶活的影響。利用Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)一步研究了NaNO3濃度、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素及交互作用對(duì)麥麩酯酶單位酶活(U/mL)的影響，確定麥麩酯酶的最佳提取工藝參數(shù)為:NaNO3濃度0.15mol/L、提取溫度35℃、提取時(shí)間60min，此條件下單位酶活的預(yù)測(cè)值為2

4、3338.0U/mL，驗(yàn)證值為23018.7U/mL，達(dá)到預(yù)測(cè)值的98.63％。
　　3.采用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系萃取麥麩酯酶粗酶液，通過考察不同聚乙二醇分子量、聚乙二醇濃度、無機(jī)鹽種類、無機(jī)鹽濃度、體系pH和外加無機(jī)鹽離子強(qiáng)度對(duì)麥麩酯酶總蛋白分配系數(shù)、酶活回收率、純化倍數(shù)的影響，并通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了萃取條件。結(jié)果表明最佳萃取條件為:PEG1000質(zhì)量濃度為21％、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為18％、pH4.4

5、?；貧w方程預(yù)測(cè)雙水相萃取純化倍數(shù)可達(dá)到2.9208，三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均純化倍數(shù)為2.9190，達(dá)到預(yù)測(cè)值的99.93％。
　　4.麥麩酯酶經(jīng)硫酸銨分段沉淀、透析及SephadexG-200凝膠層析，收集酶液超濾濃縮，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)蛋白含量，酶的比活力為289.14 U/mg·回收率為47.7％，純化倍數(shù)為16.17。經(jīng)SDS-PAGE電泳，利用蛋白分析軟件計(jì)算出麥麩酯酶的分子量約為26.0KDa。
　　5.對(duì)純

6、化后的麥麩酯酶進(jìn)行了基本酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明:最大紫外吸收峰為224nm和280nm，最適反應(yīng)溫度為30℃，溫度穩(wěn)定范圍為25～40℃，最適pH為8.0，pH穩(wěn)定范圍在4.0～8.0，Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、檸檬酸鈉、四硼酸鈉均對(duì)麥麩酯酶有抑制作用，而Fe2+、Mn2+、檸檬酸、硫酸鋁鉀對(duì)該酶有激活作用;麥麩酯酶以α-乙酸萘酯為底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Km和Vmax值分別為0.85mg·ml-1和0.93mg·mL-1·mi