動物組織中miRNA的提取分離與結(jié)構(gòu)功能預(yù)測.pdf

1、小分子 RNA(microRNA或miRNA)是一段大小為18~25個堿基的非編碼RNA,它存在于真核細胞內(nèi),可通過與靶mRNA3'完全或不完全結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或是mRNA降解。自從1993年第一條miRNA被發(fā)現(xiàn)以來,miRNA的研究一直是生命科學(xué)的研究熱門。隨著近年來研究的不斷深入,人們開始認識到 miRNA在真核基因表達調(diào)控中有著廣泛的作用。目前miRNA的研究領(lǐng)域主要包括 miRNA表達譜和 miRNA

2、功能分析。近些年來miRNA也成為臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點,鑒于miRNA的調(diào)節(jié)作用,使miRNA與眾多疾病的發(fā)生相關(guān),所以miRNA在疾病檢測及治療領(lǐng)域的研究將為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展帶來突破性進展。
　　本文以 mRNA的poly(A)結(jié)構(gòu)特點為基礎(chǔ),通過以下步驟以期篩選未知的miRNA。首先,在miRNA3'端連接poly(A),進一步對miRNA–poly(A)進行連接子連接;其次,以 oligo(T)為引物通過逆轉(zhuǎn)錄將 miRNA–p

3、oly(A)–linker轉(zhuǎn)化為cDNA并通過 PCR擴增;再次,通過電泳挑選理想長度的目的片段并進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化,以交錯PCR鑒定轉(zhuǎn)化后的單克隆菌液,通過DNA測序進一步分析目的片段。我們依據(jù)該法篩選到了已知的miRNA,表明其對于miRNA的篩選是有效而實用的。
　　本實驗在小鼠及家雞肝臟中各篩選到含18~25個堿基的疑似為miRNA的序列各一條,在miRNAbase和Rfam中檢索不到。NCBI中的BLAST比對分析表明,篩