SELEX-Seq技術繪制轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合譜的方法學研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜是指轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性識別并結(jié)合的所有DNA序列及其相對親合性，它對于研究轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合特異性和預測轉(zhuǎn)錄因子DNA靶點及靶基因都具有重要意義。目前繪制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜的方法可分為體內(nèi)和體外兩種，其中將指數(shù)富集配體進化技術(SELEX)與DNA高通量測序技術相結(jié)合產(chǎn)生的SELEX-Seq技術已經(jīng)成為繪制轉(zhuǎn)錄因子DNA體外結(jié)合譜的首選方法。
　　 核因子κB(NF-κB)是一種調(diào)控性真核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥反應、細胞免疫

2、應答和腫瘤發(fā)生等關系密切，是目前進行轉(zhuǎn)錄治療和藥物篩選的重要靶點。因此本論文采用基于電泳遷移率變動分析實驗(EMSA)的SELEX-Seq技術繪制了NF-κBp50蛋白的高分辨率DNA結(jié)合譜，設計并論證了一套新的SELEX-Seq實驗技術體系，為研究其他轉(zhuǎn)錄因子DNA體外結(jié)合譜提供切實可行的研究方法。
　　 實驗中首先設計并合成了三種序列:陽性序列、陰性序列和篩選序列，其中篩選序列是含有16bp隨機序列的單鏈寡核苷酸，序列兩端為

3、PCR引物退火恒定序列。陽性序列和陰性序列的結(jié)構基本上同篩選序列，但兩端帶有不同于篩選序列的PCR引物退火序列;陽性序列的中間為NF-κB的一個已知結(jié)合序列（野生型序列），而陰性序列的中間為野生型序列的突變序列，與NF-κB不結(jié)合。SELEX篩選前，先將三種單鏈寡核苷酸序列用單引物退火、Klenow酶延伸的方法，轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈寡核苷酸。之后采用基于EMSA的SELEX技術篩選并富集與NF-κBp50蛋白結(jié)合的DNA分子，對富集的DNA分子再

4、進行PCR擴增作為下一輪篩選的文庫。在隨機序列的每輪SELEX篩選中加入陽性序列和陰性序列，對篩選產(chǎn)物進行陽性序列和陰性序列的分別PCR擴增，判斷篩選的特異性。經(jīng)4輪SELEX篩選富集后，對各輪篩選富集的帶有標簽的DNA分子用近紅外EMSA實驗和低通量克隆測序進行分析驗證。最后，將各輪篩選樣品合并進行Hiseq2000高通量測序，對測序結(jié)果進行生物信息學分析，以獲得轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50蛋白高分辨率DNA體外結(jié)合譜:序列頻率統(tǒng)計獲得N

5、F-κBp50對各種DNA序列的相對結(jié)合親合性;對各輪篩選和測序產(chǎn)物隨機抽樣，進行MEME分析，獲得NF-κBp50DNA結(jié)合模體。
　　 實驗結(jié)果表明:(1)運用EMSA技術能夠篩選轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合序列;(2)隨機抽樣MEME可有效提取轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合模體;(3)基于EMSA的SELEX-Seq可有效地繪制轉(zhuǎn)錄因子DNA體外結(jié)合譜;(4)運用SELEX-Seq方法建立的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜可為后續(xù)DNA結(jié)合靶點及靶基因的預測和鑒定