四種人參皂苷單體對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡體液免疫的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景:
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種具有多種臨床表現(xiàn)的人類自身免疫性疾病。在大多數(shù)情況下，涉及的重要器官包括腦，心臟，關(guān)節(jié)，皮膚和腎臟。SLE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有研究表明免疫功能紊亂是其發(fā)病的主要原因之一。人參是一味傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)氣固脫，健脾益肺，寧心益智，養(yǎng)血生津的作用，人參皂甙(Ginsenoside，GS)作為人參根中提取的主要活性成分，現(xiàn)代藥理已證實(shí)GS

2、具有增強(qiáng)免疫的作用，故GS對(duì)自身免疫已經(jīng)過度活躍者是否會(huì)加重病情，GS能否用于自身免疫性疾病的治療，一直是醫(yī)學(xué)界爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。在我單位的前期研究中，采用隨機(jī)對(duì)照雙盲的前瞻性臨床試驗(yàn)證實(shí):GS可以增強(qiáng)強(qiáng)的松治療SLE的總有效率，更迅速地緩解SLE的病情活動(dòng)、降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情活動(dòng)度(SLEDAI)評(píng)分，有利于激素的順利撤減。為了進(jìn)一步研究人參皂甙對(duì)SLE患者的免疫系統(tǒng)作用，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。在本研究中，選擇前期研究較充分、中藥人參中含量較高

3、的四種人參皂苷單體:人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)，人參皂苷Rh1(Ginsenoside Rh1)，人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)和人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)，探討其對(duì)SLE的體液免疫調(diào)節(jié)的影響和作用機(jī)制。
　　研究目的:
　　通過體外實(shí)驗(yàn)研究GS單體對(duì)SLE體液免疫調(diào)節(jié)的影響，探討GS對(duì)B細(xì)胞增殖、凋亡及其對(duì)B細(xì)胞分泌的IgG和IgM的調(diào)控作用，以及對(duì)B細(xì)胞相關(guān)因

4、子及其亞群分布的影響。
　　研究方法:
　　1.人外周血單核細(xì)胞懸液制備:取健康成人外周血全血細(xì)胞，經(jīng)離心分層，用移液器取淋巴細(xì)胞層，再用PBS清洗三次，加入1mL的RMPI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以獲得單核細(xì)胞懸液(PBMC)。
　　2.CD19+B細(xì)胞分選:利用CD19磁珠抗體標(biāo)記PBMC，將標(biāo)記后的PBMC置于分選柱（LS柱）中，再將LS柱置于分選器的磁場(chǎng)中，將細(xì)胞懸液過柱并收集被標(biāo)記細(xì)胞。
　　3.細(xì)胞

5、培養(yǎng):篩選出的CD19+B細(xì)胞加入采用含10％的胎牛血清，1％雙抗液（青鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　4.BrdU法檢測(cè)不同濃度(0.1、1、10mg/L)Rb1，Rh1，Rg1，Rg3+1μg/ml LPS干預(yù)對(duì)B細(xì)胞增殖的影響，并同LPS刺激培養(yǎng)下的B細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　5.ELISA法檢測(cè)不同濃度(0.1、1、10mg/L)Rb1，Rh1，Rg1，Rg3+1μ

6、g/ml LPS干預(yù)對(duì)B細(xì)胞分泌IgG和IgM的影響，并同在LPS刺激培養(yǎng)下的B細(xì)胞的IgG與IgM分泌量進(jìn)行比較。
　　6.Western-Blot法檢測(cè)在10mg/L的Rb1，Rh1，Rg1，Rg3+1μg/ml LPS干預(yù)對(duì)B細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Fas/FasL和caspase-3的表達(dá)，并同LPS刺激培養(yǎng)下的B細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　7.RT-PCR法檢測(cè)在10mg/L的Rb1，Rh1，Rg1，Rg3+1μg/ml LPS干

7、預(yù)下B細(xì)胞相關(guān)因子的基因BAFF及BLyS及其受體及β2M的表達(dá)。
　　8.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在10mg/L的Rb1，Rh1，Rg1，Rg3+1μg/ml LPS干預(yù)下B細(xì)胞亞群CD19+CD27+CD32+的比例。
　　研究結(jié)果:
　　1.經(jīng)過磁性分離分選后的CD19+B細(xì)胞純度與分選前(17.3％)相比較大提升，為98.4％(P＜0.05)。
　　2.BrdU法結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組B細(xì)胞增殖率升高(P

8、＜0.05);與LPS組相比，四種人參皂苷單體均具有抑制B細(xì)胞增殖的作用(P＜0.05)，并且抑制作用呈劑量依賴性。
　　3.ELISA法結(jié)果顯示，與空白組相比，B細(xì)胞分泌IgG和IgM增加(P＜0.05);與LPS組相比，四種人參皂苷單體均具有抑制B細(xì)胞分泌IgG和IgM的作用(P＜0.05)，并且抑制作用呈劑量依賴性。
　　4.Western-Blot法結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組的B細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白Fas/FasL

9、和凋亡激活蛋白caspase-3的表達(dá)降低;與LPS組相比，四種人參皂苷單體均能夠增加Fas/FasL和caspase-3的表達(dá)。
　　5.RT-PCR法結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組的B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)及其受體BCMA，TACI和B細(xì)胞激活因子(BAFF)及其受體BAFF-R和β2-微球蛋白(β2M)的mRNA表達(dá)水平均上調(diào)(P＜0.05);與LPS組相比，四種人參皂苷單體均能夠下調(diào)BLyS及BAFF及其受體及β2

10、M的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS組CD27+B細(xì)胞的比例增加(P＜0.05)，CD19+B細(xì)胞的比例減少(P＜0.05)，F(xiàn)cγRIIB(CD32)的表達(dá)水平降低(P＜0.05);與LPS組相比，Rb1，Rh1和Rg3均能夠增加CD19+B細(xì)胞的比例(P＜0.05)，降低CD27+B細(xì)胞的比例(P＜0.05)，并且能增加FcγRIIB的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論: