健脾益氣方下調(diào)肝癌細(xì)胞Vimentin蛋白的機(jī)制及意義.pdf

1、目的：研究健脾益氣方下調(diào)肝癌細(xì)胞Vimentin（波形蛋白）的機(jī)制，并從肝癌細(xì)胞增殖與侵襲能力、Caspase-3凋亡途徑及NLRP3/Caspase-1炎癥信號(hào)等方面探討健脾益氣方下調(diào)Vimentin對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。
　　方法：以TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721建立上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）模型，篩選健脾益氣方含藥血清最佳干預(yù)濃度及時(shí)間。將肝癌EMT模型細(xì)胞分為七組：EMT模型組、空白血清組、健脾低劑量組、健脾中劑量

2、組、健脾高劑量組、Casp抑制組和Vim裂解組。其中，EMT模型組常規(guī)培養(yǎng)，空白血清組加入空白對(duì)照大鼠血清培養(yǎng)，健脾低、中、高劑量組分別加入用不含胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)至7.5％、15%（最佳干預(yù)濃度）、30%濃度的健脾益氣方藥含藥大鼠血清培養(yǎng)，Casp抑制組加入含終濃度為10μmol/L Z-VAD-FMK的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Vim裂解組用含終濃度為10μmol/L WFA的培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、Annexin

3、 V+PI雙染色法檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞增殖與侵襲能力的差異及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Vimentin、Caspase-3、PARP-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.15%健脾益氣方含藥血清濃度，作用48h，對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 EMT模型（10ng/ml TGF-β1，干預(yù)時(shí)間48h）增殖與侵襲的抑制效果最好。
　　2.MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及

4、Annexin V+PI雙染色法結(jié)果顯示，⑴ EMT模型細(xì)胞經(jīng)低、中、高劑量的健脾益氣方含藥血清干預(yù)后，其增殖和侵襲能力均受到抑制（P<0.01或P<0.05）；細(xì)胞早期凋亡率增加（中、高劑量健脾組P<0.01），其中以中劑量的健脾益氣方含藥血清效果最佳。⑵ Casp抑制組細(xì)胞增殖抑制率和侵襲抑制率在各實(shí)驗(yàn)組均為最低值；Casp抑制組細(xì)胞早期凋亡率也僅高于EMT模型組，甚至低于空白血清組（P<0.05）。⑶Vim裂解組細(xì)胞的增殖抑制率、

5、侵襲抑制率和早期凋亡率在各實(shí)驗(yàn)組中均為最高值。
　　3.Western blot結(jié)果顯示，與空白血清組比較，健脾中、高劑量組含藥血清均可以降低肝癌細(xì)胞Vimentin、PARP-1、NLRP3和Caspase-1蛋白水平（P<0.01），升高Caspase-3蛋白水平（P<0.01）。其中，健脾中、高劑量組Vimentin和PARP-1蛋白的下調(diào)程度與二者的裂解程度，及肝癌細(xì)胞的增殖抑制率、侵襲抑制率和凋亡率趨勢(shì)一致；中劑量組對(duì)P

6、ARP-1、Caspase-3蛋白的下調(diào)或上調(diào)力度要優(yōu)于高劑量組。Vim裂解組各蛋白水平趨勢(shì)與健脾組一致，但下調(diào)或上調(diào)程度更明顯（P<0.01）。與EMT模型組和空白血清組相比，Casp抑制組肝癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-1與NLRP3水平下調(diào)（P<0.01），PARP-1水平上調(diào)（P<0.01），Vimentin水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Vimentin和PARP-1無蛋白裂解片段出現(xiàn)。
　　結(jié)論：

7、　　1.15%濃度的健脾益氣方含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的干預(yù)效果最佳，它可能是通過下調(diào)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Vimentin蛋白的水平來抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲、并誘導(dǎo)部分肝癌細(xì)胞凋亡；
　　2.導(dǎo)致Vimentin下調(diào)的原因可能在于Caspase-3對(duì)它的裂解。此過程中，健脾益氣方一方面利用Caspase-3/Vimentin裂解片段形成的正反饋促凋亡信號(hào)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，另一方面可能利用Vimenti