局灶節(jié)段腎小球硬化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)作為導(dǎo)致成人及兒童激素抵抗腎病綜合征和腎功能衰竭最常見的原因之一，其病理生理機(jī)制仍不清楚。FSGS診斷依靠腎活檢，其病理特征包括局灶節(jié)段性腎小球硬化，和足突的彌漫融合。然而，由于病變小球往往位于皮質(zhì)深部接近髓質(zhì)處，腎活檢易遺漏，給FSGS的診斷帶來一定困難。FSGS根據(jù)病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和家族性。家族性FSGS（Familial

2、FSGS，F(xiàn)FSGS）也叫遺傳性FSGS，占非繼發(fā)性FSGS9％左右。FSGS患者臨床通常表現(xiàn)為大量蛋白尿，部分表現(xiàn)為腎病綜合征范圍的蛋白尿，對這部分患者治療主要包括激素和免疫抑制劑，根據(jù)對足量激素的療效可分為激素敏感、激素依賴和激素抵抗，激素依賴和抵抗患者容易進(jìn)展至終末期腎臟病(ESRD)。
　　轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)情況的研究方法。以往報道關(guān)于FSGS的轉(zhuǎn)錄水平的研究，采用材料多來自腎組織（包括腎小球和小管間質(zhì)）的

3、石蠟標(biāo)本，由于FSGS為足細(xì)胞疾病，納入腎小管和間質(zhì)將造成結(jié)果偏差，此外石蠟組織中RNA的降解難以避免。因此，本研究在倒置顯微鏡下分離FSGS患者活檢腎組織中的腎小球，最大限度的保持患者腎小球轉(zhuǎn)錄本的完整性。并通過高通量的Microarray分析方法直接對患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究，以期從轉(zhuǎn)錄水平上，發(fā)現(xiàn)FSGS的發(fā)病機(jī)制。此外，本研究不僅入選原發(fā)性FSGS患者，還入選攜帶基因突變的遺傳性FSGS患者和激素抵抗FSGS患者，將從不同角度

4、，全面探討FSGS的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異，從而深入了解FSGS的致病機(jī)制。
　　本研究第一部分納入6例原發(fā)性FSGS患者，5例MCD患者，兩組患者接受腎穿刺時均未接受激素和/或免疫抑制劑治療，且所有入組患者都表現(xiàn)為激素敏感，排除治療反應(yīng)的差異對Microarray結(jié)果的影響。倒置顯微鏡下極細(xì)尖頭鑷分離患者腎活檢皮質(zhì)組織中腎小球，對兩組患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Microarray分析，重點(diǎn)對兩種疾病的基因表達(dá)的差異進(jìn)行了詳盡的分析。Micr

5、oarray結(jié)果提示，F(xiàn)SGS與MCD患者腎小球轉(zhuǎn)錄本相比:參與生殖細(xì)胞形成、泛素化過程、蛋白刺激反應(yīng)、肌肉收縮的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增生和骨骼系統(tǒng)發(fā)育的基因高表達(dá);而參與合成和分解代謝過程、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞定位的形成的基因低表達(dá)。并通過RT-PCR方法在另外7例FSGS與7例MCD患者腎小球轉(zhuǎn)錄本中驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)趨勢與Microarray結(jié)果一致。并發(fā)現(xiàn)膜金屬肽鏈內(nèi)鈦酶（membrane metallo endopeptida

6、se，MME）蛋白在FSGS患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于MCD患者，提示MME可作為潛在的區(qū)別FSGS、MCD的生物學(xué)標(biāo)志物，同時提示MME可能參與FSGS的發(fā)生。
　　除了原發(fā)性FSGS，以往研究發(fā)現(xiàn)一部分家族性FSGS患者為足細(xì)胞相關(guān)分子突變引起，提示與原發(fā)性FSGS存在不同機(jī)制。本課題組前期研究在漢族人FSGS家系中成功發(fā)現(xiàn)COL4A3基因雜合突變可引起漢族人家族性FSGS。本研究第二部分，納入3例攜帶Ⅳ型膠原α3鏈（COL

7、4A3）基因突變的FFSGS患者(C1616Y，G801R，L737H)和5例MCD患者。通過對其臨床資料的回顧性整理統(tǒng)計，觀察FFSGS與MCD兩組患者臨床特點(diǎn)的差別，結(jié)果顯示與MCD相比，攜帶COL4A3基因突變FFSGS患者發(fā)病較早，較少發(fā)生腎病綜合征，合并鏡下血尿較多，尿蛋白水平較低，血漿白蛋白水平較高，腎活檢時FFSGS患者腎小球?yàn)V過率較低。對兩組患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Microarray分析，結(jié)果顯示攜帶COL4A3基因突變

8、的FFSGS患者腎小球轉(zhuǎn)錄本與MCD患者腎小球轉(zhuǎn)錄本相比，參與細(xì)胞間及細(xì)胞表面受體信號傳導(dǎo)、神經(jīng)信號傳遞、認(rèn)知、感官直覺、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的基因呈現(xiàn)高表達(dá);而參與合成及分解代謝、蛋白質(zhì)裂解及泛素化過程，和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的基因呈現(xiàn)低表達(dá)。挑選前6位上調(diào)，和前6位下調(diào)表達(dá)的基因，采用RT-PCR方法在相同患者腎組織轉(zhuǎn)錄本中驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)趨勢，結(jié)果顯示相關(guān)基因表達(dá)趨勢與Microarray結(jié)果一致。GBM主要由Ⅳ型膠原（COL4A3

9、）組成，在臨床工作中，一部分FSGS患者活檢腎組織GBM在EM下呈節(jié)段性改變，但該病理改變的機(jī)制以及臨床意義不明。此外，先前研究本課題組發(fā)現(xiàn)，COL4A3基因雜合突變攜帶者可見GBM節(jié)段性變薄，與典型薄基底膜腎病(TBMN)以及AS的電鏡下特征不同。因此我們通過分析合并GBM節(jié)段變薄的FSGS患者與GBM無病變的FSGS患者的臨床、病理數(shù)據(jù)，以期發(fā)現(xiàn)GBM節(jié)段變薄對患者臨床、病理以及預(yù)后的影響。通過對63例合并GBM局灶變薄的FSGS患

10、者與60例GBM無病變的FSGS患者臨床資料的比較分析，結(jié)果顯示與GBM無病變的FSGS患者相比，合并GBM局灶變薄的FSGS患者尿蛋白水平明顯較高，血漿白蛋白水平較低，腎小球?yàn)V過率較低，且血紅蛋白水平較低。兩組患者腎病綜合征、血尿的比例，病理表現(xiàn)以及治療反應(yīng)未見明顯差異。
　　FSGS的主要治療包括激素和免疫抑制劑，根據(jù)以往數(shù)據(jù)顯示，大約1/3FSGS患者對激素治療反應(yīng)差，但具體機(jī)制不明。本研究第三部分通過納入6例臨床表現(xiàn)為激素

11、敏感腎病綜合征(SSNS)的原發(fā)性FSGS患者，3例臨床表現(xiàn)為激素抵抗腎病綜合征(SRNS)的原發(fā)性FSGS患者，對兩組患者腎小球的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Microarray分析，觀察兩組患者基因表達(dá)的差異。結(jié)果顯示與FSGS-SSNS患者腎小球轉(zhuǎn)錄本相比，F(xiàn)SGS-SRNS患者腎小球轉(zhuǎn)錄本中:參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸及其衍生物代謝，離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程的基因呈現(xiàn)高表達(dá);而參與人體器官組織形成、DNA依賴的轉(zhuǎn)錄過程調(diào)節(jié)、MAPK活性的負(fù)向調(diào)控的基因呈現(xiàn)低表達(dá)。RT

12、-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示相關(guān)基因的表達(dá)趨勢與Microarray結(jié)果一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示STRA6(stimulated by retinoic acidgene6 homolog)基因編碼蛋白在FSGS-SRNS患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于FSGS-SSNS患者。提示STRA6的低表達(dá)可能與SRNS的FSGS發(fā)生有關(guān)，因此，我們提出STRA6可作為鑒別FSGS治療反應(yīng)的潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，同時提示STRA6可能參與FSGS-SRNS

13、的發(fā)生。
　　綜上所述，本研究入選臨床特征為SSNS的原發(fā)性FSGS患者，遺傳性FSGS患者（攜帶COL4A3雜合突變）和SRNS的FSGS患者，入選MCD患者作為對照組，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，得到了FSGS的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)圖譜。結(jié)果顯示:SSNS患者，遺傳性FSGS患者與MCD患者腎小球轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異明顯。與SSNS患者相比，SRNS患者腎小球轉(zhuǎn)錄本差異明顯。差異表達(dá)的基因中，參與生殖細(xì)胞形成、泛素化過程、合成和分解代謝過程等的基因在S

14、SNS和MCD患者中表達(dá)差異明顯;參與細(xì)胞間及細(xì)胞表面受體信號傳導(dǎo)、神經(jīng)信號傳遞、認(rèn)知、感官直覺、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的基因;參與合成及分解代謝、蛋白質(zhì)裂解及泛素化過程，和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的基因，在遺傳性FSGS和MCD患者中表達(dá)差異明顯;參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸及其衍生物代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程、人體器官組織形成、DNA依賴的轉(zhuǎn)錄過程調(diào)節(jié)等的基因在SRNS與SSNS患者中表達(dá)差異明顯。
　　MME基因及其編碼蛋白在FSGS患者腎小球中的表達(dá)量

15、明顯低于MCD患者，提示MME可作為潛在的區(qū)別FSGS、MCD的生物學(xué)標(biāo)志物，同時提示MME可能參與FSGS的發(fā)生。STRA6基因及其編碼蛋白在SRNS的FSGS患者腎小球中的表達(dá)量明顯低于SSNS的FSGS患者。提示STRA6可作為鑒別FSGS治療反應(yīng)的潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，同時提示STRA6可能參與FSGS-SRNS的發(fā)生
　　我們發(fā)現(xiàn)一部分散發(fā)性FSGS患者也表現(xiàn)為GBM節(jié)段性變薄，進(jìn)一步分析合并與不合并GBM節(jié)段變薄的FSG