CD11b與CD27定義的人類NK細(xì)胞亞群在HIV疾病進(jìn)展中的變化及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：NK細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分，無需抗原預(yù)先致敏，即可直接殺傷腫瘤、病毒或細(xì)菌感染的靶細(xì)胞，是機(jī)體免疫防御的第一道防線，在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。HIV感染是目前全世界未能攻克的難題，越來越多的研究證明，NK細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)在抵抗HIV感染中發(fā)揮著重要的作用。NK細(xì)胞是一群異質(zhì)性的細(xì)胞，由于CD56的發(fā)現(xiàn)將人類NK細(xì)胞重新劃分了不同亞群，然而CD56抗原不表達(dá)在嚙齒動(dòng)物，且以CD56為標(biāo)志的NK細(xì)胞分群

2、不能更好地對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行功能性分群，因此研究者們不斷的探索NK細(xì)胞新的分群方法，以便于發(fā)現(xiàn)更好的功能性分群標(biāo)志物。在2011年首次報(bào)道了應(yīng)用CD11b和CD27定義人類NK細(xì)胞不同亞群和功能特異性。根據(jù)CD11b和CD27定義了人類NK細(xì)胞4個(gè)亞群，分別為CD11b-CD27+(CD27+SP)，CD11b+CD27+(DP)，CD11b-CD27-(DN)，CD11b+CD27-(CD11b+SP)，可以反映了人類NK細(xì)胞不同的亞群和

3、功能特異性。研究報(bào)道CD11b與CD27定義的NK細(xì)胞亞群在肺癌患者中發(fā)生明顯的變化，并且與肺癌疾病進(jìn)展有關(guān)，提供了腫瘤逃脫NK細(xì)胞調(diào)節(jié)腫瘤免疫的一個(gè)新的機(jī)制。那么，作為HIV感染過程中最先參與抗病毒反應(yīng)的NK細(xì)胞，是否NK細(xì)胞功能的紊亂與四個(gè)亞群的改變有關(guān)？以及亞群的變化與HIV疾病進(jìn)展是否有關(guān)？相關(guān)機(jī)制如何？國(guó)內(nèi)外未報(bào)道，值得我們?nèi)ド钊胙芯亢吞剿?。本研究為了探究在HIV感染過程中NK細(xì)胞的功能紊亂是否與CD27與CD11b定義的亞群

4、改變有關(guān)，以及各亞群的變化與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系和發(fā)生的機(jī)制。為更好的防治HIV病毒感染以及研究HIV發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)，同時(shí)為HIV病毒逃脫NK細(xì)胞調(diào)節(jié)的抗病毒免疫提供一個(gè)新的機(jī)制。
　　方法：選取中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診的HIV感染者，包括新發(fā)感染者、慢性感染者、HARRT治療者，以及正常對(duì)照者。實(shí)驗(yàn)方法包括：CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值檢測(cè)將CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，逆向

5、加樣法加入抗凝全血，加入1×免洗溶血素，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，MultiSET軟件分析結(jié)果；HIV病毒載量測(cè)定取EDTA抗凝血漿，采用Roche公司COBAS(@) AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@) System自動(dòng)載量?jī)x上以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定病毒載量；NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞表面受配體的檢測(cè)采用全血染色，加入相應(yīng)的熒光抗體及同型對(duì)照等進(jìn)行避光染色。加入溶血素，1％多聚甲醛F

6、ACS LSRⅡ流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)；CD27與CD11b定義的NK細(xì)胞亞群分泌IFN-γ的情況提取HIV感染者PBMC，于96孔板中加入刺激物，在收細(xì)胞前6h加入Golgistop，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收細(xì)胞，加入熒光抗體表面染色，離心洗滌后破膜胞內(nèi)IFN-γ遮光染色，1％多聚甲醛上機(jī)檢測(cè)；血清中可溶性ICAM-1的檢測(cè)采用ELISA方法檢測(cè)正常人和HIV感染者血清中可溶性ICAM-1，按照說明書操作步驟進(jìn)行操作；TGF-β對(duì)CD11b

7、與CD27定義的NK細(xì)胞亞群表達(dá)量的影響提取正常人PBMC，與TGF-β共培養(yǎng)。加入熒光抗體，1％多聚甲醛固定上機(jī)檢測(cè)；含高濃度可溶性ICAM-1的HIV感染者血漿對(duì)CD27與CD11b定義的NK細(xì)胞亞群的影響提取正常人PBMC，加入含有高濃度可溶性ICAM-1的HIV感染者血清，培養(yǎng)48h。熒光單克隆抗體染色，離心洗滌，加入1％多聚甲醛上機(jī)檢測(cè)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較組間差異采用參數(shù)檢驗(yàn)或者非參數(shù)檢驗(yàn)。

8、相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：⑴HIV感染者CD11b與CD27定義的NK細(xì)胞亞群發(fā)生明顯的變化且與疾病進(jìn)展有關(guān)。HIV慢性感染者表達(dá)的CD11b顯著降低，經(jīng)治療后有所恢復(fù)但仍低于正常人(P＜0.001)。HIV感染者NK細(xì)胞未成熟DN亞群在慢性感染者中明顯增多，經(jīng)HARRT治療后，雖有所恢復(fù)但仍顯著高于正常入水平(P＜0.001)。殺傷功能亞群CD11b+SP在慢性感染者顯著降

9、低，經(jīng)治療后有所恢復(fù)但仍低于正常人水平(P＜0.001)。HIV感染者中未成熟DN亞群與CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)成負(fù)相關(guān)(r=-0.320，P=0.012)，殺傷功能亞群CD11b+SP與CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)成正相關(guān)(r=0.375，P=0.003)。HIV慢性感染者CD27+SP亞群與病毒載量成顯著的正相關(guān)(r=0.548，P=0.015)。CD27+SP亞群和DN亞群在HIV感染者中不論疾病進(jìn)展好還是不好均高于正常人，但疾病進(jìn)展不好的人

10、群表達(dá)的較疾病進(jìn)展好的人群高。CD11b+SP正常人顯著高于HIV感染者，但疾病進(jìn)展好的HIV感染者高于疾病進(jìn)展不好的人群。⑵HIV感染者CD11b與CD27定義的NK細(xì)胞亞群功能研究。CD27+SP、DP、CD11b+SP亞群分泌IFN-γ的功能明顯高于DN亞群。⑶傳統(tǒng)NK細(xì)胞亞群與CD11b和CD27定義NK細(xì)胞亞群的區(qū)別與聯(lián)系。與CD27和CD11b定義的NK細(xì)胞亞群相比，傳統(tǒng)的NK細(xì)胞亞群與HIV疾病進(jìn)展關(guān)系并不顯著。在CD56

11、bright亞群中主要表達(dá)DP和CD11b+SP亞群，在CD56dim亞群中主要表達(dá)CD11b+SP亞群。DN亞群與CD56bright亞群呈負(fù)相關(guān)，CD27+SP亞群和DP亞群與CD56dim呈顯著負(fù)相關(guān)，CD11b+SP與CD56dim呈顯著正相關(guān)。⑷HIV感染者CD11b與CD27定義的NK細(xì)胞亞群變化的相關(guān)機(jī)制研究。將TGF-β與PBMC共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β能明顯促進(jìn)未成熟DN亞群增多，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04

12、5)。HIV感染者CD4+T細(xì)胞上膜性ICAM-1與正常人相比無明顯的變化，而HIV感染者血清中sICAM-1表達(dá)水平增高(P＜0.001)，HARRT治療后雖然有所降低但仍高于正常入水平(P=0.004)。將含有高濃度sICAM-1的HIV感染者血清與正常人PBMC共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，加入含有高濃度sICAM-1的HIV感染者血清的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組未成熟DN亞群明顯增高而殺傷功能亞群CD11b+SP明顯降低。
　　結(jié)論：①與正常入相