肝外膽管系統(tǒng)中CD63+干細(xì)胞的識(shí)別鑒定及其修復(fù)肝臟損傷能力的研究.pdf

1、肝臟干細(xì)胞是一類具有自我更新能力并可分化為成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的肝臟原始細(xì)胞，它們參與肝臟發(fā)育、生長和損傷修復(fù)與再生的過程。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞作為細(xì)胞移植的治療用細(xì)胞與成熟肝細(xì)胞等其它類型細(xì)胞相比至少有以下優(yōu)點(diǎn):1）肝臟干細(xì)胞植入受體后增殖能力強(qiáng)并有重構(gòu)肝干細(xì)胞巢的潛能;2）肝干細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞;3）體外對肝干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增比成熟肝細(xì)胞相對容易;4）肝干細(xì)胞為原始未分化狀態(tài)細(xì)胞，相對于

2、其他細(xì)胞，免疫原性很低。因此，我們認(rèn)為肝干細(xì)胞很可能是理想的肝臟疾病治療用細(xì)胞的來源。然而，現(xiàn)有的研究已經(jīng)知道存在于肝臟內(nèi)的干細(xì)胞的數(shù)量極少，再加上正常肝臟組織的來源很不容易，所以在基于肝干細(xì)胞肝臟疾病治療中多元的治療用細(xì)胞來源則是一個(gè)值得解決的問題。鑒于肝內(nèi)和肝外膽管在發(fā)育上、功能上和空間上的連續(xù)性，以及其它實(shí)驗(yàn)室關(guān)于肝外膽管中有干性細(xì)胞存在的報(bào)道，我們意識(shí)到了利用肝外膽管組織來解決肝臟疾病治療用干細(xì)胞來源匱乏的可能性?；谶@一考慮，

3、本研究希望回答兩個(gè)基本的生物學(xué)問題:1）肝外膽管中的什么細(xì)胞是真正的干細(xì)胞？2）它們是否具有類似的肝干細(xì)胞生物學(xué)特性和修復(fù)肝臟損傷的能力？
　　肝外膽管組織包括膽囊、囊管、左右肝管、肝總管和膽總管。有研究表明，正常肝外膽管系統(tǒng)中存在于/前體細(xì)胞（Biliary tree stem/progenitor cells，BTSCs），并認(rèn)為這些細(xì)胞具有分化為成熟肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞或胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞等類型細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能。Rohan M

4、anohar等人在小鼠膽囊中發(fā)現(xiàn)并鑒定EpCAM+CD49fhi的上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征;Guido Carpino等人則利用EpCAM陽性細(xì)胞符合干細(xì)胞的特性，從人的膽囊內(nèi)分離出EpCAM+K7+Lgr5+Sox17+Pdx1+的內(nèi)胚層干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)分離獲得的這些細(xì)胞表現(xiàn)出未分化細(xì)胞的特征，并且在體外具有自我更新能力以及可以被誘導(dǎo)分化為多種類型的細(xì)胞。然而，這些研究中“干性細(xì)胞”群體依賴表面標(biāo)志物EpCAM，而這個(gè)標(biāo)志物不能區(qū)分膽管上

5、皮細(xì)胞和干細(xì)胞，具有異質(zhì)性，且針對這些細(xì)胞只是簡單檢測了一些指標(biāo)，并未深入研究細(xì)胞的相關(guān)特性?？偨Y(jié)起來，現(xiàn)有研究存在的主要問題有:1）缺少肝外膽管系統(tǒng)干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志;2）缺少肝外膽管系統(tǒng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系;3）體內(nèi)損傷修復(fù)能力不明確。本研究圍繞以上問題展開研究，試圖為肝外膽管系統(tǒng)中干細(xì)胞是否可以作為供體細(xì)胞在臨床上治療肝病中提供線索。
　　我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明CD63是肝內(nèi)膽管干細(xì)胞特異性的表面分子標(biāo)志物。因此，針對

6、目前缺少肝外膽管系統(tǒng)干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志，我們嘗試以CD63為線索，來探討小鼠和人肝外膽管系統(tǒng)中是否有細(xì)胞表達(dá)CD63，以及這些細(xì)胞是否具有干細(xì)胞的特性和修復(fù)肝臟損傷的能力。首先，通過原位免疫組織化學(xué)染色分別檢測小鼠和人的肝外膽管內(nèi)是否有細(xì)胞表達(dá)CD63，以及這些CD63+細(xì)胞是否共表達(dá)肝干細(xì)胞的分子標(biāo)志。第二，以CD63為分選標(biāo)志利用流式分選技術(shù)分離純化肝外膽管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞，并對這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系及生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。第三，將分

7、離獲得的CD63細(xì)胞移植到肝損傷動(dòng)物模型當(dāng)中，觀察其是否具有再殖并修復(fù)疾病損傷的能力。
　　對于小鼠肝外膽管系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn):1）原位免疫組化染色顯示，小鼠肝外膽管系統(tǒng)存在干性細(xì)胞，且這些細(xì)胞共表達(dá)肝干細(xì)胞分子標(biāo)志CK19、EpCAM和Alb，但不表達(dá)間質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)志α SMA;我們利用Ⅳ型膠原酶和胰酶聯(lián)合處理消化小鼠肝外膽管組織，利用肝干細(xì)胞培養(yǎng)基ScmA可以將這些細(xì)胞在體外進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增，且這些細(xì)胞在基因和蛋白水平均表達(dá)EpCAM

8、、CK19、Alb、N-cadherin、Sox9、Pan-CK和E-Cadherin等肝干細(xì)胞分子標(biāo)志，體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明這些細(xì)胞能被誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞;2）鑒于CD63可以作為肝內(nèi)肝干細(xì)胞特異性的分子標(biāo)志，我們首先在原位鑒定了小鼠肝外膽管組織中存在CD63+細(xì)胞，且這些細(xì)胞共表達(dá)肝干細(xì)胞分子標(biāo)志EpCAM、CK19、Alb和Lgr5;繼而通過流式分選將小鼠肝外膽管內(nèi)CD63+細(xì)胞分離純化后，基于前期建立的肝干細(xì)胞培養(yǎng)基條件

9、，通過改良后添加生長因子:bFGF和VEGF，可以將這些細(xì)胞在體外穩(wěn)定培養(yǎng)和增殖（大于30代）;3）通過抽提RNA和細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些小鼠肝外膽管CD63+細(xì)胞在基因水平和蛋白水平表達(dá)CK19、Sox9和EpCAM等肝干細(xì)胞分子標(biāo)志;4）體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠CD63+細(xì)胞可以被誘導(dǎo)為具有合成糖原、吲哚菁綠的攝入和排出及具有LDL受體等成熟肝細(xì)胞的功能和表型，以及能夠形成囊管狀結(jié)構(gòu)（且囊管結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞具有極性）和運(yùn)輸羅丹明等

10、成熟膽管上皮細(xì)胞的功能;5）將標(biāo)記了綠色熒光蛋白(GFP)的小鼠CD63+細(xì)胞移植入延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶(Fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)ah)基因缺陷(Fah-/-)小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞不僅可以分化為成熟肝細(xì)胞來再殖入受損的肝臟(再殖效率可高達(dá)19.69％)，還可以分化為膽管上皮細(xì)胞（再殖效率可高達(dá)10.85％），這也是首次在Fah-/-小鼠體內(nèi)觀察到有移植的干細(xì)胞可以分化為膽管上皮細(xì)胞。說明小鼠肝

11、外膽管系統(tǒng)中CD63+細(xì)胞確實(shí)是真正的干細(xì)胞，其不僅具有肝干細(xì)胞基本特性，而且具有較好的修復(fù)肝臟損傷的能力。
　　對于人肝外膽管系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn):1）與小鼠結(jié)果類似，在人的膽囊、囊管和膽總管中均有細(xì)胞表達(dá)CD63，且這些CD63+細(xì)胞共表達(dá)肝干細(xì)胞分子標(biāo)志;2）通過Ⅰ型膠原酶消化的方法可以獲得肝外膽管組織的單細(xì)胞懸液，體外培養(yǎng)的這些細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)和高核質(zhì)比等干細(xì)胞特征，且在體外可以增殖3代以上;3）以CD63為分選標(biāo)志通過流式分

12、選前后的肝外膽管細(xì)胞在基因和蛋白水平均表達(dá)肝干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志。說明在人肝外膽管內(nèi)存在干細(xì)胞，但是具體的分離純化和體外培養(yǎng)體系還需要深入的研究。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了肝外膽管系統(tǒng)中干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志，明確了其存在的空間位置，建立了其干細(xì)胞直接從肝外膽管組織中分離培養(yǎng)的技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)了其干細(xì)胞增殖與分化特性的研究。進(jìn)而，完成了其干細(xì)胞在肝臟損傷小鼠模型中的再殖效率和治療作用的評估。這些研究成果的取得，正面地回答了我們最