尿液游離microRNAs作為膀胱癌早期診斷和分期預測標志物的實驗及臨床研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 膀胱癌尿液microRNAs RT-qPCR檢測最適內(nèi)參基因的選擇與驗證
　　目的：
　　本研究旨在對膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的內(nèi)參基因進行系統(tǒng)篩選和驗證，確定可用于膀胱癌尿液游離miRNAs RT-qPCR檢測的最適內(nèi)參基因。
　　方法：
　　1.收集6例膀胱癌和6例健康對照尿液上清，采用Miseq高通量測序技術對兩組樣本進行分析，選擇拷

2、貝數(shù)大于50，在兩組樣本中表達無差異且在兩組之間倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子作為候選的內(nèi)參基因。
　　2.采用RT-qPCR技術在80例膀胱癌和80例健康對照尿液上清中對測序篩選出的候選內(nèi)參基因和目前常用內(nèi)參基因U6snRNA進行初步驗證。
　　3.利用NormFinder和geNorm軟件評估內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，確定最適的內(nèi)參基因。
　　4.采用RT-qPCR技術在63例膀胱癌和63例健康對照尿液上清中對篩選確

3、定的最適內(nèi)參基因進行評估。
　　結(jié)果：
　　1.候選內(nèi)參基因的測序篩選:膀胱癌組和健康對照者組比較發(fā)現(xiàn)，根據(jù)篩選標準，拷貝數(shù)大于50，兩組間表達無差異且兩組倍數(shù)小于1.2的miRNAs分子為13個，同時也將U6snRNA作為候選內(nèi)參基因納入進行下一步驗證。
　　2.候選內(nèi)參基因的RT-qPCR驗證:在上述14個候選的內(nèi)參基因中，有4個miRNAs分子在尿液上清標本中無法檢測到;2個miRNAs分子（miR-194-5p

4、和miR-99b-5p）的PT-qPCR檢測的平均Cq值大于35;7個miRNAs和U6snRNA在所有尿液上清樣本中均可檢測到且Cq均值小于35。
　　3.確定的內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性評估:利用NormFinder和geNorm兩個軟件評估上述7個確定的miRNAs分子和U6snRNA的穩(wěn)定性，兩個軟件均顯示let-7b-5p是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，let-7b-5p和miR-532-5p組合是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。
　　結(jié)

5、論：
　　let-7b-5p和miR-532-5p組合可作為膀胱癌和健康對照尿液游離miRNAsRT-qPCR檢測的最適內(nèi)參基因。
　　第二部分 基于尿液microRNAs表達譜的膀胱癌診斷模型的構(gòu)建及臨床應用研究
　　目的：
　　本研究旨在系統(tǒng)篩選膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達譜，進一步運用logistic回歸分析構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌診斷模型用于膀胱癌的診斷。
　　方法：
　　1

6、.收集6例膀胱癌和6例健康對照尿液上清，采用Miseq高通量測序技術對兩組樣本進行分析，選擇在兩組樣本中表達呈顯著差異且兩組之間倍數(shù)大于2的miRNAs作為候選miRNAs分子。
　　2.采用RT-qPCR技術在150例膀胱癌和150例健康對照尿液上清中對上一步測序篩選出的候選miRNAs分子進行驗證。并采用受試者工作曲線(ROC)評估驗證后的呈差異表達的miRNAs分子對膀胱癌的診斷效能。
　　3.通過logistic回歸

7、分析將驗證出的對膀胱癌具有診斷價值的miRNAs分子構(gòu)建膀胱癌診斷模型。
　　結(jié)果：
　　1.差異miRNAs測序篩選:高通量測序結(jié)果顯示，膀胱癌和健康對照尿液上清中拷貝數(shù)大于50的miRNAs分子分別為256和308個。在兩組間表達呈顯著差異且倍數(shù)大于2的miRNAs分子為23個，其中在膀胱癌組中呈高表達的為16個。
　　2.差異miRNAs分子的RT-qPCR驗證:將上述23個呈差異表達的miRNAs分子在150例

8、膀胱癌和150例健康對照尿液上清中進行RT-qPCR檢測驗證，結(jié)果顯示miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p和miR-375在膀胱癌組的表達顯著高于健康對照組（均P＜0.05），miR-200a-3p和miR-423-5p在膀胱癌組的表達顯著低于健康對照組（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　尿液游離miR-7-5p、miR-22-3p、miR-29a-3p、miR-126-5p、m

9、iR-375、miR-200a-3p和miR-423-5p可以作為潛在腫瘤標志物用于膀胱癌的診斷，構(gòu)建的7-miRNAs診斷模型能夠用于膀胱癌的早期診斷，并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細胞學檢測;miR-22-3p和miR-200a-3p為非肌層浸潤性膀胱癌復發(fā)的獨立預測因子。上述結(jié)果為膀胱癌的無創(chuàng)性診斷和非肌層浸潤性膀胱癌的復發(fā)預測提供了一條的新的途徑。
　　第三部分 基于尿液microRNAs表達譜的膀胱癌分期預測模型的構(gòu)建及臨床應

10、用
　　目的：
　　本研究旨在篩選肌層浸潤性膀胱癌特異尿液游離miRNAs表達譜，進而采用logistic回歸分析構(gòu)建基于尿液游離miRNAs的膀胱癌分期預測模型用于肌層浸潤性膀胱癌的術前預測。
　　方法：
　　1.收集6例肌層浸潤性膀胱癌、6例非肌層浸潤性膀胱癌和6例健康對照尿液上清，采用Miseq高通量測序技術對三組樣本進行分析，初步篩選差異表達miRNAs作為候選miRNAs分子。
　　2.采用RT-

11、qPCR技術在113例肌層浸潤性膀胱癌、113非例肌層浸潤性膀胱癌和156例健康對照尿液上清中對測序篩選出的候選miRNAs分子進行驗證。確定肌層浸潤性膀胱癌特異的miRNAs分子，采用受試者工作曲線(ROC)評估上述特異的miRNAs分子對肌層浸潤性膀胱癌的預測效能。
　　3.運用logistic回歸分析將驗證出的對肌層浸潤性膀胱癌具有預測價值的miRNAs分子構(gòu)建膀胱癌分期預測模型。
　　結(jié)果：
　　1.差異miR

12、NAs測序篩選:高通量測序結(jié)果顯示，大于50個拷貝的miRNAs分子在肌層浸潤性膀胱癌中為235個，非肌層浸潤性膀胱癌中為188個，健康對照者中為276個。根據(jù)篩選標準，大于50拷貝，在三組之間兩兩表達呈顯著差異且倍數(shù)大于2的miRNAs分子為24個。
　　2.候選miRNAs分子的RT-qPCR驗證:將上述24個差異表達的miRNAs分子在113例肌層浸潤性膀胱癌、113例非肌層浸潤性膀胱癌和156例健康對照中尿液上清中進行RT

13、-qPCR驗證，結(jié)果顯示miR-24-3p和miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組表達顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌組和健康對照組（均P＜0.05），同時，其在非肌層浸潤性膀胱癌組表達顯著高于健康對照組（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　尿液游離miR-24-3p和miR-1246可以作為潛在腫瘤標志物用于膀胱癌的分期預測，構(gòu)建的2-miRNAs膀胱癌分期預測模型能夠在術前預測肌層浸潤性膀胱癌，并且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)尿液脫落細胞學檢測

14、和病理分級;miR-24-3p為肌層浸潤性膀胱癌預后的獨立判斷因子。上述結(jié)果為肌層浸潤性膀胱癌的術前預測和預后判斷提供了一條的新的途徑。
　　關鍵詞:肌層浸潤性膀胱癌;microRNAs;腫瘤標志物;預測;預后
　　第四部分 microRNAs分子在膀胱癌組織中表達及生物學功能研究
　　目的：
　　本研究旨在檢測膀胱癌分期預測模型中的microRNAs (miRNAs)分子在肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌組

15、織中的表達情況。通過體外調(diào)控膀胱癌細胞系中miRNAs分子的表達水平，進行相關細胞功能實驗，探討上述miRNAs分子在膀胱癌增殖、遷移、侵襲及凋亡等過程中的生物學功能，明確其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找膀胱癌潛在的治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用RT-qPCR技術檢測35例肌層浸潤性膀胱癌及35例非肌層浸潤性膀胱癌新鮮冰凍組織及T24膀胱癌細胞系中miR-24-3p和miR-1246的表達情況。選取差異表

16、達miRNAs分子，進一步檢測其在肌層浸潤性膀胱癌組織及配對癌旁正常組織中的表達情況。
　　2.體外用脂質(zhì)體2000將miR-1246 mimics、miR-1246 inhibitor和對應的陰性對照序列轉(zhuǎn)染T24膀胱癌細胞系，同時利用RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)果顯示，miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織中的表達水平顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌組織(P＜0.05)，而miR-24-3p表

17、達在肌層浸潤性膀胱癌組織與非肌層浸潤性膀胱癌組織之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.相比于mock組和miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-1246mimics24小時后，T24膀胱癌細胞中miR-1246的表達水平顯著上調(diào)(P＜0.001)。相比于mock組和miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor24小時后，T24膀胱癌細胞中miR-1246的表達水平顯著下調(diào)（P＜ 0.05）。
　　3.相比于mock

18、組和miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-1246 mimics的T24膀胱癌細胞在轉(zhuǎn)染后48小時、72小時、96小時增殖均明顯增快，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　相比于非肌層浸潤性膀胱癌，miR-1246在肌層浸潤性膀胱癌組織中表達水平顯著上調(diào)。進一步體外細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，miR-1246在膀胱癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用，顯著促進膀胱癌進展。本研究將為尋找膀胱癌新的治療靶點提供理論依