CP4-EPSPS溯源用標(biāo)準(zhǔn)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與制備.pdf

1、5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS：EC2.5.1.19)是莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)與SP3(莽草酸-3-磷酸)生成EPSP(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸)，為芳香族氨基酸的合成提供前體物質(zhì)，該酶廣泛地存在于微生物及高等植物體內(nèi)。由于EPSPS是除草劑草甘膦的靶標(biāo)酶，所以篩選高抗草甘膦EPSP

2、S新基因的研究工作被廣泛展開，來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium sp.)CP4菌株的EPSPS對高濃度的草甘膦表現(xiàn)出非常高的抗性，此后該基因被廣泛地應(yīng)用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研究中，截止2010年，包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等，播種面積近8930萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物中都含有該抗除草劑基因。面對大量含有CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因的作物或食品進(jìn)口我國，建立科學(xué)的檢測方法尤為迫切。雖然現(xiàn)在市場上有多種用于轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)測定的試劑盒

3、，但不同廠商采用不同的工藝表達(dá)以及方法確定參考物質(zhì)的量值，無法溯源到上一級的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，造成測定結(jié)果不準(zhǔn)確和缺乏可比性，由此給生物安全監(jiān)管帶來隱患，并產(chǎn)生一系列法律、貿(mào)易等經(jīng)濟(jì)和社會問題。
　　 為獲得穩(wěn)定來源并且具有高純度的CP4-EPSPS蛋白，本研究首先構(gòu)建了CP4-EPSPS的細(xì)菌表達(dá)載體，并首次實(shí)現(xiàn)此基因在大腸桿菌BL21(transtta)菌種中的表達(dá)。超聲波破碎菌體后，發(fā)現(xiàn)該重組蛋白并未以包涵體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，而

4、是以可溶的形式存在于細(xì)胞破碎上清液中，為下游的蛋白純化工作帶來極大的便利，通過二步鎳柱親和層析后，CP4-EPSPS重組蛋白的純度可達(dá)99.9％以上，符合作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。
　　 為驗(yàn)證所提純的CP4-EPSPS蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可行性，本文構(gòu)建了CP4-EPSPS植物表達(dá)載體，通過組培的方法，獲得了49株檢測為陽性的煙草苗。經(jīng)過Elisa驗(yàn)證16株煙草有明顯的表達(dá)。以提純的CP4-EPSPS蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，稀釋成不同的濃度