硫化氫拮抗低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬障礙及其機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)，自噬具有抗動(dòng)脈粥樣硬化（As）作用。在As的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬普遍存在。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬受抑制時(shí)，會(huì)使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損從而促As的發(fā)生和發(fā)展。在血管分叉處、彎曲血管內(nèi)側(cè)以及血管分支處，最容易發(fā)現(xiàn)As病灶和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在這些部位，血流動(dòng)力學(xué)特征有很大改變，產(chǎn)生異常剪切應(yīng)力。雖然有研究表明，高剪切應(yīng)力或低剪切應(yīng)力都能促進(jìn)As的形成。但高剪切應(yīng)力的病變條件已經(jīng)遠(yuǎn)超正常生理水平，因此眾多學(xué)者更傾向于

2、低剪切應(yīng)力是更主要的病變因素。又有研究表明，低剪切應(yīng)力會(huì)抑止血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬作用。
　　硫化氫(H2S)是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，它具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促血管生成、抗氧化以及抗As作用等。有研究表明，H2S能夠通過(guò)AMPK途徑誘導(dǎo)保護(hù)性自噬，抑制癌變結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖。因此,本研究擬以AMPK為切入點(diǎn)，通過(guò)建立低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 HUVECs自噬障礙模型，探討 H2S抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的HUVE

3、Cs自噬障礙的新機(jī)制。
　　方法與結(jié)果：
　　1、結(jié)扎小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，保留較細(xì)的甲狀腺動(dòng)脈血液通路，得到血流減慢，但并未停滯的低剪切應(yīng)力血流模型，未結(jié)扎的對(duì)側(cè)為正常剪切應(yīng)力血流模型，采用免疫熒光染色法檢測(cè)H2S合酶胱硫醚γ裂解酶（Cystathionine-γ-lyase, CSE）的蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則分別采用正常剪切應(yīng)力（15dyne/cm2）以及低剪切應(yīng)力（5dyne/cm2）處理HUVECs1小時(shí)后，用West

4、ern blot法檢測(cè)CSE的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常處理組相比，低剪切應(yīng)力組中CSE蛋白表達(dá)水平明顯降低。這說(shuō)明在低剪切應(yīng)力作用下CSE表達(dá)被抑制，導(dǎo)致H2S生成減少。
　　2、分別采用正常剪切應(yīng)力（15dyne/cm2）以及低剪切應(yīng)力（5dyne/cm2）處理 HUVECs1小時(shí)后，用Western blot法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin1、P62的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示低剪切應(yīng)力組LC3、Beclin1明顯降低，

5、自噬障礙標(biāo)志物P62明顯升高。這說(shuō)明在低剪切應(yīng)力下，HUVECs的自噬受到抑制，并發(fā)生了自噬障礙。
　　3、不同濃度(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L) NaHS預(yù)處理HUVECs30min后，再采用低剪切應(yīng)力處理HUVECs1h，Western blot結(jié)果顯示，與0μmol/L組相比，H2S可拮抗低剪切應(yīng)力處理后導(dǎo)致的細(xì)胞自噬障礙。并且這種拮抗作用呈濃度依賴性。
　　4、將細(xì)胞隨機(jī)分

6、為3組：正常剪切應(yīng)力(15dyne/cm2)組，低剪切應(yīng)力(5dyne/cm2)組，5mmol/L PPG+低剪切應(yīng)力組。其中 PPG預(yù)處理細(xì)胞30min，再采用剪切應(yīng)力處理 HUVECs1h。結(jié)果表明，與低剪切應(yīng)力5dyne/cm2組相比，PPG組細(xì)胞自噬減少。減少內(nèi)源性H2S的生成加重低剪切應(yīng)力致HUVECs自噬減弱。
　　5、將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常剪切應(yīng)力（15dyne/cm2）組，低剪切應(yīng)力(5dyne/cm2)組，10

7、0μmol/L NaHS＋5dyne/cm2組，5mmol/L PPG＋5dyne/cm2組。預(yù)處理細(xì)胞30min后再采用剪切應(yīng)力處理1h。結(jié)果顯示，與正常組相比,5dyne/cm2組與PPG+5dyne/cm2組p-AMPK/AMPK水平下降, mTOR表達(dá)升高，NaHS+5dyne/cm2組無(wú)明顯變化，表明補(bǔ)充外源性H2S可拮抗低剪切應(yīng)力致AMPK失活。
　　6、將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，正常剪切應(yīng)力（15dyne/cm2）組，低剪

8、切應(yīng)力（5dyne/cm2）組，100μmol/L NaHS＋5dyne/cm2組，AMPK抑制劑Compound C＋5dyne/cm2組， Compound C＋100μmol/L NaHS＋5dyne/cm2組。預(yù)處理細(xì)胞30min后再采用剪切應(yīng)力處理1h。結(jié)果顯示，與5dyne/cm2組相比，NaHS+5dyne/cm2組p-AMPK/AMPK及LC3表達(dá)增高而mTOR表達(dá)降低，Compound C+5dyne/cm2組LC3表