真核表達(dá)CatSper1用于篩選有效siRNA的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 小鼠CatSper1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)
　　 目的：獲得能表達(dá)CatSper1基因開放讀碼框的質(zhì)粒，在真核細(xì)胞中表達(dá)CatSper1 mRNA，以用于篩選有效siRNA。
　　 方法：利用已有文獻(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)資源進(jìn)行雄性小鼠CatSper1基因的生物信息學(xué)分析，以重組PCR的方法，以小鼠睪丸cDNA為模板擴(kuò)增CatSper1基因開放讀碼框，將CatSper1片段插入到載體pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)上，獲取pE

2、GFP-N1-CatSper1質(zhì)粒，并對其進(jìn)行測序驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：通過重組PCR技術(shù)，成功克隆了雄性小鼠CatSper1基因整個(gè)開放讀碼框的cDNA，全長為2061bp。將其插入到載體pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)中，測序證實(shí)了克隆和載體構(gòu)建的正確性。
　　 結(jié)論：對預(yù)測的小鼠CatSper1基因的克隆，將CatSper1片段插入到載體pEGFP的多克隆位點(diǎn)上，成功獲取了pEGFP-N1-CatSper1重組質(zhì)粒。

3、r>　　 第二部分 體外有效siRNA序列的篩選
　　 目的：利用化學(xué)合成小分子siRNA，干擾小鼠成神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞外源CatSper1基因的表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA序列。
　　 方法：生物信息分析軟件和校正結(jié)果，獲得三條針對雄性小鼠CatSper1的siRNA序列，合成后分別與重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CatSper1共轉(zhuǎn)染到小鼠成神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞株中，通過觀察EGFP熒光強(qiáng)度、實(shí)時(shí)定量PCR和West

4、ern Blot等方法分析干擾效果，篩選能顯著降低N2a細(xì)胞中外源性CatSper1表達(dá)量的RNAi序列。
　　 結(jié)果：三條針對CatSper1的siRNA組的 mRNA和蛋白表達(dá)與空白對照組相比均有下降，其中以靠近3’端的siRNA（1870-CCTTGAAGATGCAGCTTAT-1889）干擾作用最為明顯，siRNA3組為最佳干擾序列，與空白對照組比較降低了79％。陰性對照siRNA組未引起CatSper1 mRNA和Ca