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文檔簡介
1、目的:食物不耐受逐漸引起了現(xiàn)在臨床醫(yī)生及相關研究人員的廣泛關注,若是確定患者機體內(nèi)的不耐受組分則可以使疾病得到有效的預防和治療。本文以牛奶為例,分析引起牛奶不耐受的蛋白組分并進行初步分離,進而用已確定的蛋白組分作為已知抗原,研制雙抗原夾心法測定牛奶特異性抗體的檢測方法以及生物素-鏈霉親和素間接包被法測定牛奶中特異性免疫球蛋白G(IgG)的方法。
方法:在本研究中,選取由牛奶引起的不耐受患者血清(抗體)為探針,采用SDS-PAG
2、E和酶免疫印記技術,分析能與不耐受患者血清相結合的蛋白區(qū)帶確定為不耐受原。采用選擇沉淀、凝膠過濾等技術純化以確定不耐受的組分,經(jīng)酶免疫印記和酶聯(lián)免疫實驗確定分離蛋白的免疫活性。雙抗原夾心法分別包被抗原和標記抗原,經(jīng)棋盤滴定法確定檢測體系中最佳用量。間接包被法采用生物素標記牛血清白蛋白-鏈霉親和素制備酶標反應板、并用生物素標記已知抗原,同時使用酶標記抗人IgG作為標記抗體;特異性IgG水平經(jīng)雙抗原夾心法獲得的IgG標準曲線獲得。
3、 結果:牛奶中與不耐受血清發(fā)生結合的組分包括免疫球蛋白(Ig,160kDa)、牛血清白蛋白(BSA,67kDa)酪蛋白(CN,30kDa),同時β乳球蛋白(BLG,17kDa)以及α乳白蛋白(ALA,14kDa)也顯示出與患者血清結合的反應。采用等電點沉淀、凝膠過濾和離子交換層析等技術可獲得酪蛋白、β乳球蛋白、α乳白蛋白和分子量較大的P1組分(牛血清白蛋白和免疫球蛋白)。
雙抗原夾心法可用于牛奶特異性抗體測定,以美國Biome
4、rica酶聯(lián)免疫(間接法)作為參比方法,雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法敏感度為93.3%,特異度為100%,準確度為96.7%;陽性預測值為100%,陰性預測值為93.7%。間接包被模式的食物特異性IgG酶聯(lián)免疫法可應用于不耐受患者血清特異性IgG檢測,同樣也以美國Biomerica酶聯(lián)免疫作為參比方法,牛奶特異性IgG測定敏感度為92.1%,特異度為90.0%,準確度為91.0%。建立的兩種方法均與原有的方法比較符合程度都很高。
結論
5、:
1、與食物過敏不同,牛奶中引起食物不耐受的成分是一些大分子蛋白:免疫球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白等;同時不耐受個體間不耐受成分基本相同,個體間只是抗體效價的不同。
2、食物特異性IgG檢測試劑的性能主要決定于所用的已知抗原。每種食物蛋白組分復雜,對食物蛋白鑒別和初步純化是非常必要的。
3、雙抗原夾心法可用于食物不耐受特異性IgG檢測,與間接法相比具有較好的特異性。新型間接包被模式可以用于食物不耐受特異性
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