AUDA經(jīng)Smad-p38途徑減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的研究.pdf

1、目的:特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明的慢性間質(zhì)性肺炎，預(yù)后差，患者一經(jīng)確診平均存活時間約為3-5年。發(fā)病特征是肺實質(zhì)逐漸纖維化，導(dǎo)致肺功能進行性喪失、呼吸困難和低氧血癥，最終因呼吸衰竭而死亡。環(huán)氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids，EETs)是花生四烯酸經(jīng)細胞色素P450表氧化酶作用生成的代謝物，具有舒張血管、抗炎和抗纖維化等作用。EETs

2、在體內(nèi)可被可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)代謝迅速轉(zhuǎn)化為活力較低的二醇形式:二羥基-20碳三烯酸(Dihydroxy-20-carbon triple acids，DHETs)。抑制sEH可提高EETs水平，增加其體內(nèi)的生物學(xué)活性。本研究將探索sEH抑制劑對博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的作用，并初步研究其作用機制。博萊霉素用于治療不同類型的惡性腫瘤，最嚴重的副作用是肺毒性，博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖

3、維化模型是世界上公認的動物模型，因此本論文以博萊霉素刺激小鼠建立肺纖維化模型，研究sEH抑制劑AUDA體內(nèi)抗纖維化作用。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化（fibroblast-myofibroblast transformation, FMT）被認為是纖維化病變的重要原因，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor

4、-beta1，TGF-β1）是誘導(dǎo)EMT和FMT的一個重要因子，因此以TGF-β1刺激上皮細胞建立EMT模型、刺激成纖維細胞建立FMT模型，研究sEH抑制劑AUDA抑制上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的作用。
　　方法:整體實驗，ICR小鼠隨機分為空白組，模型組，AUDA3 mg/kg，AUDA10 mg/kg組。氣管內(nèi)滴注3 mg/kg博萊霉素建立IPF模型，一周后分別灌胃給藥。造模后第四周，用BUXCO肺功能

5、儀測定小鼠肺功能，并收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)計數(shù)其中的白細胞總數(shù)，巨噬細胞數(shù)，淋巴細胞數(shù)和中性粒細胞數(shù);左上肺肺組織勻漿后用實時定量PCR(qRT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定TGF-β1、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達;qRT-PCR和免疫印

6、跡(Western blot)方法檢測肺組織纖維化相關(guān)蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達及相關(guān)信號通路蛋白的表達，檢測羥脯氨酸水平;左下肺制作組織切片，進行蘇木精-伊紅染色(H&E)和Masson染色檢測。離體實驗，采用MTT法檢測細胞活力，評價AUDA對上皮細胞與成纖維細胞增殖的影響;TGF-β1刺激人支氣管上皮細胞株(16HBE)建立EMT細胞模型，給予AUDA干預(yù)研究其對EMT的調(diào)節(jié)作用

7、并探討其作用的可能信號通路;TGF-β1刺激人肺成纖維細胞株(HFL-1)使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，給予AUDA干預(yù)研究其對成纖維細胞-肌成纖維細胞間轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:整體實驗:灌胃給予AUDA可顯著改善BLM引起的小鼠體重下降及肺功能Penh值升高，顯著減少BALF中白細胞總數(shù)，抑制淋巴細胞數(shù)和中性粒細胞數(shù)增多，下調(diào)肺組織中TGF-β1、IL-1β、MMP-9 mRNA及蛋白高表達，緩解BLM誘發(fā)的肺泡結(jié)構(gòu)破壞與肺組織實

8、質(zhì)病變，減少肺組織中的膠原纖維沉積及羥脯氨酸的水平，通過Smad/p38途徑使肺組織中纖維化相關(guān)蛋白α-SMA水平下調(diào)、E-cadherin水平上調(diào)，改善肺纖維化病理程度。
　　離體實驗:AUDA可有效抑制上皮細胞和成纖維細胞增殖;TGF-β1刺激16 HBE細胞48 h，可上調(diào)α-SMA表達、下調(diào)E-cadherin表達，誘導(dǎo)EMT，AUDA通過Smad2、Smad3和p38途徑抑制EMT; TGF-β1刺激HFL-1細胞48