應用兩種生物模式探討抗VEGF單克隆抗體BD0801的抗血管生成作用.pdf

1、目的:
　　應用兩種生物模式探討人源化抗VEGF單克隆抗體BD0801單藥或聯合細胞毒藥物的抗血管生成作用，并初步探討其機制。
　　方法:
　　1、BD0801單藥實驗:
　　斑馬魚實驗:采用24hpf(hours post fertilization，hpf,受精后小時)健康血管熒光轉基因斑馬魚胚胎實驗動物模型，脫去外膜后隨機分組:BD0801低濃度組，BD0801中濃度組，BD0801高濃度組;貝伐珠單抗(B

2、ev)低濃度組，Bev中濃度組，Bev高濃度組;魚水對照組（陰性對照組）。加入藥物與胚胎共同孵育48小時后在熒光顯微鏡下觀察背部節(jié)間血管(intersegmental vessels，ISV)生成數目，采用實時定量RT-PCR檢測各組胚胎VEGFmRNA的相對表達量。
　　雞胚尿囊膜(CAM)實驗:采用九日齡雞胚作為實驗對象，隨機分為七組:BD0801低濃度組，BD0801中濃度組，BD0801高濃度組;貝伐珠單抗(Bev)低濃度

3、組，Bev中濃度組，Bev高濃度組;生理鹽水對照組（陰性對照組）。暴露CAM后植入甲基纖維素碟，加入各組藥物，72小時后觀察血管生長情況，計算緊鄰甲基纖維素碟旁一個視野內的血管數目，并進行比較。
　　2、BD0801聯合細胞毒藥物實驗:
　　斑馬魚實驗:在單藥實驗取得陽性結果的基礎上，采用24hpf健康血管熒光轉基因斑馬魚胚胎作為實驗動物模型，脫去外膜后隨機分組:BD0801單藥處理組和BD0801聯合OXA處理組、BD08

4、01聯合5-FU處理組;Bev單藥處理組（陽性對照組）和Bev聯合OXA處理組（陽性對照組）、Bev聯合5-FU處理組（陽性對照組）、OXA和5-FU單藥處理組（陽性對照組）、魚水對照組（陰性對照組）。加入藥物與胚胎共同孵育48小時后在熒光顯微鏡下觀察背部節(jié)間血管(intersegmental vessels，ISV)生成數目，采用實時定量RT-PCR檢測各組胚胎VEGF mRNA的相對表達量。
　　雞胚尿囊膜(CAM)實驗:采用

5、九日齡雞胚作為實驗對象，隨機分為七組BD0801單藥處理組和BD0801聯合OXA處理組、BD0801聯合5-FU處理組;Bev單藥處理組（陽性對照組）和Bev聯合OXA處理組（陽性對照組）、Bev聯合5-FU處理組（陽性對照組）、OXA和5-FU單藥處理組（陽性對照組）。暴露CAM后植入甲基纖維素碟，加入各組藥物，72小時后觀察血管生長情況，計算緊鄰甲基纖維素碟旁一個視野內的血管數目，并進行比較。
　　結果:
　　BD08

6、01單藥實驗:
　　1、與陰性對照組相比，BD0801能夠有效抑制斑馬魚胚胎ISV生成(P＜0.05)，與陽性藥物Bev相比，BD0801抑制作用更強，抑制作用與藥物濃度呈正相關。RT-PCR檢測結果顯示:BD0801可以下調斑馬魚胚胎組織VEGF mRNA的水平(P＜0.05)，與陽性對照組相比，下調作用更強，且與藥物濃度呈正相關。
　　2、與陰性對照組相比，BD0801具有抑制CAM血管生長的作用(P＜0.05)，與陽性

7、藥物Bev相比，抑制作用更強，抑制作用與藥物濃度呈正相關。
　　BD0801聯合細胞毒藥物實驗:
　　1、與陰性對照組相比，BD0801單藥、Bev單藥、OXA單藥、5-FU單藥及各聯合用藥組能夠有效抑制斑馬魚胚胎ISV生成(P＜0.05)，與單藥組相比，聯合用藥組抑制作用更強(P＜0.05)。且與Bev聯合用藥相比，BD0801聯合用藥對血管抑制程度更強(P＜0.05)。RT-PCR檢測結果顯示:BD0801單藥、Bev單

8、藥、OXA單藥、5-FU單藥及各聯合用藥組VEGF基因mRNA的表達被下調，聯合用藥組的下調程度強于單藥組，且與Bev聯合用藥組相比，BD0801聯合用藥組VEGF基因mRNA的表達量更低。
　　2、與陰性對照組相比，BD0801單藥、Bev單藥、OXA單藥、5-FU單藥及各聯合用藥組具有抑制CAM血管生長的作用(P＜0.05)，與單藥組相比，聯合用藥組抑制作用更強(P＜0.05)。與Bev聯合用藥相比，BD0801聯合用藥抑制血

9、管的作用更強(P＜0.05)。
　　結論:
　　BD0801能夠有效抑制斑馬魚及CAM模型的血管生成，且作用強于Bev，其作用機制可能與下調組織細胞VEGFmRNA的水平有關;BD0801聯合5-FU/OXA可協同抑制斑馬魚及CAM模型血管生成，其作用機制可能與協同下調組織細胞VEGF mRNA的水平有關。本研究提示，BD0801單藥或聯合5-FU/OXA可能通過靶向VEGF而有效抑制斑馬魚及CAM模型血管生成，值得進一步深