小鼠成體干細胞體外誘導成肝能力比較及與絲素蛋白纖維相容性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.分離、培養(yǎng)小鼠脂肪及骨髓間充質(zhì)干細胞，比較兩種成體干細胞體外增殖能力、多向分化潛能及向肝臟樣細胞誘導分化的能力;
　　2.比較兩種成體干細胞與絲素蛋白纖維在體外和體內(nèi)的相容性，以及在絲素蛋白纖維上誘導成肝能力;
　　3.比較兩種成體干細胞及兩種成體干細胞復合絲素蛋白纖維移植改善急性肝損傷小鼠肝功能的效果。
　　方法：
　　1.采用膠原酶Ⅰ消化離心法分離、培養(yǎng)小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞;采用骨片法分

2、離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)細胞;通過細胞形態(tài)學比較兩種成體干細胞的形態(tài)差異，CCK8測定細胞生長曲線、流式細胞技術(shù)檢測細胞表面標志物，成脂、成骨誘導分化能力分析比較兩種細胞的體外增殖能力及多向分化潛能;采用成肝誘導培養(yǎng)基將兩種成體干細胞向肝臟樣方向誘導，在誘導第10天，收集細胞，通過RT-PCR，Western-Blot技術(shù)、細胞免疫熒光技術(shù)對兩種成體干細胞向肝臟樣細胞誘導分化的能力進行鑒定、比較。
　　2.體外采實驗部分HE染色、掃

3、描電鏡技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡細胞活體3D成像技術(shù)檢測兩種成體細胞與絲素蛋白纖維的粘附性及增殖情況;體內(nèi)實驗部分將絲素蛋白纖維材料移植到小鼠背上，在移植后的第3、4個月取材，采用HE染色觀察材料的降解情況;將CM-Dil熒光標記的兩種成體干細胞移植到RSF材料上，并移植到急性肝損傷小鼠模型肝臟表面，在不同時間點（2天、5天、7天、14天、1個月）用小動物活體顯像技術(shù)及熒光顯微鏡觀察移植細胞的在材料上的定植情況，同時采用HE染色的方法觀察不

4、同時間點（2天、5天、7天、14天、1個月、2個月、3個月）移植細胞材料在肝臟表面的定植、分化情況以及RSF材料與肝臟組織的相容性。
　　3.采用CCl4（0.5ml/kg，100ul/20g體重）腹腔注射法構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型;采用熒光追蹤技術(shù)觀察經(jīng)尾靜脈移植到小鼠體內(nèi)的CM-Dil標記的兩種成體干細胞，并將分別兩種成體干細胞與材料復合后移植到肝臟表面，采用全自動生化分析儀檢測實驗組和對照組（N=5只）小鼠肝功能，并采用HE染

5、色法不同實驗組和對照組肝臟組織學的改變。
　　4.統(tǒng)計學方法:采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，用T檢驗、單因素所方差分析對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.采用膠原酶Ⅰ培養(yǎng)的ADSCs和骨片法培養(yǎng)的BMSCs細胞均呈長梭形，旋渦狀生長，兩者形態(tài)基本一致。兩種成體干細胞增殖曲線均呈“S”型，CCK8檢測增殖活性無統(tǒng)計學差異(P＜0.05);兩種成體干細胞表型均表達CD90.2、CD29，不

6、表達CD11b、CD45，無統(tǒng)計學差異;兩種成體干細胞經(jīng)誘導后均出現(xiàn)脂滴和骨結(jié)節(jié)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示相比于對照組細胞，兩個實驗細胞組高表達ALB、AFP、CK18、CK19、CYP1A1肝細胞相關(guān)基因;Western蛋白定量的結(jié)果顯示:與對照組相比，兩種成體干細胞中ALB、AFP、CK18、CK19、CYP1A1的蛋白表達量均升高，無明顯差異。成肝誘導后細胞免疫熒光顯色提示兩種細胞均檢測到組ALB、AFP、CK18、CK19、CY

7、P1A1的表達。
　　2.體外實驗部分:HE染色可見細胞均勻分布于材料表面，材料內(nèi)部也有少許細胞;掃描電鏡顯示兩種成體干細胞在RSF材料上呈旋渦狀生長，形態(tài)基本不變，粘附性良好;激光共聚焦細胞活體3D成像結(jié)果顯示兩種不同成體干細胞在材料不同層面上均可以生長。體內(nèi)實驗部分:小鼠背部絲素蛋白材料移植后第3、4個月HE染色顯示材料與組織相容性良好;小動物活體顯像和熒光顯微鏡觀察顯示CM-Dil熒光標記的兩種成體干細胞-絲素蛋白纖維復合材

8、料移植后的2天、5天、7天、14天和1個月均能檢測到CM-Dil熒光標記的兩種成體干細胞;HE染色結(jié)果顯示在成體干細胞-RSF復合材料移植的2天、5天、7天、14天、1個月、2個月、3個月材料與肝組織間相容性良好，無大量炎癥細胞浸潤，移植在背部的RSF材料在第4個月幾乎完全降解，移植在肝臟的RSF材料在第3個月幾乎完全降解;此外，在第5天和第7天發(fā)現(xiàn)材料有新生血管生成，在2個月和3個月觀察到新生的肝臟樣細胞。
　　3.成功構(gòu)建了小

9、鼠急性肝衰的動物模型;細胞移植組小鼠存活狀況好于CCl4注射組。熒光示蹤技術(shù)顯示經(jīng)尾靜脈移植的兩種成體干細胞均能在肝臟定植，在移植的第1天、2天、3天、7天均可在肝臟檢測到熒光標記的細胞，第3天數(shù)量達到最大，第7天標記的細胞數(shù)量減少。肝功能檢測顯示:在第1天、2天、3天細胞治療組和細胞-材料治療組均顯示出了對急性肝損傷小鼠肝功能的救治作用，而細胞-材料治療組肝功能改善作用最好，在第7天，所有小鼠肝功能基本恢復正常;HE染色顯示:治療組肝

10、細胞脂肪樣變性和肝小葉中央靜脈的淤血壞死區(qū)域有不同程度的改善。
　　結(jié)論：
　　1.兩種成體干細胞具有類似的體外的增殖能力，且均能有效地誘導成為肝臟樣細胞;ADSCs取材容易，不涉及倫理問題，原代即增殖迅速，短期內(nèi)可獲得大量細胞，因此是生物人工肝的種子細胞的優(yōu)良選擇。
　　2.ADSCs和BMSCs均可較好的在在RSF材料能夠粘附、增殖，并且兩者具有良好的生物相容性。說明可能兩種成體干細胞-RSF材料是一種良好的生物人