BmNPV orf7a基因的功能分析及GP64的表面展示.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)orf7a基因(Bm7a)的開放閱讀框編碼一個(gè)53氨基酸殘基的多肽。通過同源性比較發(fā)現(xiàn),僅有五種桿狀病毒中有Bm7a的相似序列,這五種病毒分別是:野蠶核型多角體病毒(B.Mandarina NPV,BomaNPV),豆銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa nigrisigna NPV,AuniNPV),小菜蛾核型多角體病毒(Plut

2、ella xylostella NPV,PlxyNPV),苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(A.californica MNPV,AcMNPV),和尺蠖核型多角體病毒(Rachiplusia ou MNPV,RoMNPV)。Bm7a與AcMNPV orf15a的堿基序列有91%同源性,但AcMNPVorf15a由于位于呼ORF內(nèi),通常認(rèn)為不表達(dá)。結(jié)構(gòu)分析表明,Bm7a的表達(dá)產(chǎn)物在N-端有信號(hào)肽。為了證實(shí)該基因的功能,用3'RACE(3'rap

3、id amplification of cDNA ends,cDNA3味端快速擴(kuò)增)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了Bm7a的轉(zhuǎn)錄,構(gòu)建了重組病毒分析Bm7a表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明,Bm7a從12～72h.p.I(Hours postinfection,感染后小時(shí).)都有轉(zhuǎn)錄,且Bm7a與bv/odv-e26和orf9以一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄單元方式共轉(zhuǎn)錄;通過融合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)作為可視分子標(biāo)簽,在感染過程中跟蹤定位BM7a,通

4、過激光共聚焦顯微鏡觀察,熒光主要分布在細(xì)胞膜,說明在被感染細(xì)胞中BM7a-eGFP融合蛋白由BM7a的N-端信號(hào)肽引導(dǎo)至質(zhì)膜;用eGFP抗體進(jìn)行免疫印跡分析,結(jié)果表明,BM7a-eGFP融合蛋白出現(xiàn)在出芽病毒粒子(BV)中;這些數(shù)據(jù)說明BM7a是病毒BV的組成成分。本研究首次確定了BmTa基因具有功能,該表達(dá)產(chǎn)物在BV包裝過程中起作用。
　　 桿狀病毒的表面展示可以用于篩選細(xì)胞的配體結(jié)構(gòu)等,相似于噬菌體的表面展示。為了解桿狀病毒

5、GP64能否展示在缺失該基因的組IINPV的病毒粒子上,利用組IAcMNPV的GP64信號(hào)肽(GP64SP),C-末端跨膜區(qū)(GP64CTD)及報(bào)告基因egfp構(gòu)成的表面展示系統(tǒng)(gp64sp-egfp-gp64ctd),同源重到組IIHaSNPV(Helicoverpa armigera single NPV)的多角體基因位置,篩選獲得重組病毒。通過激光共聚焦顯微鏡觀察,HaSNPV重組病毒感染Hz-Aml細(xì)胞后綠色熒光分布在質(zhì)膜,表

6、明GP64SP可以引導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物趨向于細(xì)胞膜。重組病毒大量感染Hz-Aml細(xì)胞后,收集并純化重組的出芽病毒(BV),經(jīng)Western blot檢測(cè),eGFP存在于重組病毒BV中。結(jié)果表明,組INPV的GP64表面展示系統(tǒng)中的重要元件GP64SP和GP64CTD能夠裝配到組IINPV的HaSNPV BV上,可以用于組IINPV表面展示目的蛋白。展示系統(tǒng)中egfp基因可以被其他目的基因替換,而且GP64CTD部分帶有6xHis標(biāo)簽,利于展示目