基于組胺H3受體的抗缺氧化合物篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、缺氧是指機(jī)體供氧不足或用氧障礙，根據(jù)缺氧機(jī)制不同分為乏氧性缺氧、循環(huán)性缺氧、血液性缺氧、組織性缺氧。高原地區(qū)特有的低壓低氧環(huán)境使機(jī)體因供氧不足而產(chǎn)生乏氧性缺氧，進(jìn)而引發(fā)各種急慢性高原病。高原病防治措施主要有吸氧、習(xí)服、藥物防治等，藥物防治仍是亟需解決的問題。目前用于臨床及在研的高原病防治藥物主要有醋氮酰胺（碳酸酐酶抑制劑）、地塞米松、抗氧化劑、促紅細(xì)胞生成肽、傳統(tǒng)中藥（紅景天、復(fù)方黨參片）等。其中醋氮酰胺和地塞米松療效較為明確，但此類藥

2、物因嚴(yán)重的副作用而限制其廣泛應(yīng)用。因此，探索新的抗缺氧損傷藥物靶標(biāo)，研發(fā)安全有效的高原病防治藥物至關(guān)重要。
　　組胺H3受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，相關(guān)研究表明組胺H3受體參與缺氧缺血腦損傷的病理發(fā)展過程，且在缺氧條件下與呼吸調(diào)節(jié)相關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果表明急進(jìn)高原模型下，相關(guān)腦區(qū)組胺H3受體表達(dá)發(fā)生改變；組胺H3受體反向激動(dòng)劑Pitolisant在密閉缺氧模型下可提升動(dòng)物的耐缺氧能力。進(jìn)一步探討組胺H3受體作為缺氧損傷調(diào)節(jié)靶標(biāo)

3、的可能性，闡明組胺H3受體配體抗缺氧作用的機(jī)制，并篩選靶向組胺H3受體的抗缺氧化合物，將有利于發(fā)現(xiàn)新的抗高原缺氧藥物。
　　研究目的：
　　1、系統(tǒng)評價(jià)Pitolisant的抗缺氧效應(yīng)，并闡明其可能的抗缺氧機(jī)制；
　　2、初步評價(jià)靶向組胺H3受體的Pitolisant衍生物的抗缺氧效應(yīng)，以期獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗缺氧化合物。研究方法：
　　1、用急性常壓密閉缺氧模型（250 ml廣口瓶模型）和急性低壓缺氧模型（

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低壓氧艙模擬海拔10000 m）上評價(jià)Pitolisant靜態(tài)抗缺氧能力，并觀察Pitolisant對小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響；
　　2、分別在靜脈注射亞硝酸鈉（80 mg/kg）及步入式低壓氧艙（海拔5000 m）模擬連續(xù)缺氧環(huán)境下，用小動(dòng)物跑輪運(yùn)動(dòng)疲勞模型，評價(jià)常壓及低壓狀態(tài)下Pitolisant抗運(yùn)動(dòng)缺氧作用；
　　3、采用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙（8000 m,6 h）模擬急進(jìn)高原缺氧模型，用乳酸（lactic acid

5、，LD）、腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）測試盒檢測腦組織能量代謝狀態(tài)，采用蘇木素-伊紅
　?。℉ematoxylin-Eosin，HE）染色方法觀察神經(jīng)元、腦血管形態(tài)學(xué)變化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測缺氧相關(guān)分子變化，評價(jià)Pitolisant對急性高原缺氧造成腦損傷的作用；
　　4、采用CHO-PKAcat-EGFP-HRH3細(xì)胞系，通過蛋白激酶A（protein kinase A，P

6、KA）重分布實(shí)驗(yàn)，評價(jià)Pitolisant衍生物對組胺H3受體的激動(dòng)及拮抗活性；
　　5、采用常壓密閉缺氧模型（150 ml、250 ml廣口瓶），初步評價(jià)Pitolisant衍生物的抗缺氧作用，并觀察Pitolisant衍生物對小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、在常壓密閉缺氧模型上Pitolisant（1.0、3.0、10.0 mg/kg）可劑量依賴地延長動(dòng)物的存活時(shí)間，延長百分率分別為（1.1％、11.

7、4％、64.3％）；在急性致死性低壓低氧模型上，Pitolisant（0.1、0.3、1.0 mg/kg）可劑量依賴地延長動(dòng)物中位存活時(shí)間，提高存活率。Pitolisant在此劑量范圍內(nèi)并未表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)靜作用；
　　2、Pitolisant（0.1、0.3、1.0 mg/kg）可劑量依賴地提升亞硝酸鈉缺氧動(dòng)物跑輪耐力，Pitolisant可提升急性及亞急性低壓缺氧動(dòng)物的跑輪耐力。腦組織HE染色結(jié)果表明Pitolisant（1.0

8、 mg/kg）可改善血管源性腦水腫；3、Pitolisant（0.1、0.3、1.0 mg/kg）降低急進(jìn)高原所造成的腦組織乳酸
　　累積，降低百分率為（1.3%、8.8%、17.3%）。Pitolisant能夠下調(diào)急進(jìn)高原（8000 m,6 h）模型小鼠腦組織的ATPase代償性增高。缺氧環(huán)境下，Pitolisant（1.0 mg/kg）具有下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth facto

9、r，VEGF）（腦水腫相關(guān)）表達(dá)的趨勢；
　　4、采用PKA重分布試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WH-1-42（EC50=1.08±0.53μmol）、WH-3-15（EC50=1.15±0.31μmol），WH-3-10（EC50=9.69±1.90 nmol）對組胺H3受體具有拮抗活性。采用常壓密閉缺氧模型發(fā)現(xiàn)WH-3-10、WH-3-15可顯著延長缺氧動(dòng)物的存活時(shí)間，結(jié)構(gòu)鑒定證實(shí)WH-3-10與Pitolisant是同一化合物；而WH-3-15存