Exenatide通過p38MAPKγ途徑調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注能量代謝模式.pdf

1、第一部分：Exenatide對正常SD大鼠心肌缺血/再灌注心功能及底物選擇的影響
　　目的：探討胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)類似物艾塞那肽(Exenatide,Ex)對缺血再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)后正常SD大鼠心功能保護(hù)作用及對膜上葡萄糖（Glucose,Glu）、游離脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)節(jié)作用及和p3

2、8MAPK信號途徑的關(guān)系。
　　方法：建立正常SD(Sprague Dawley)大鼠心肌I/R模型。Western blot檢測 Exenatide對 I/R前后心肌細(xì)胞內(nèi) p38MAPKα（p38α）、p38MAPKγ（p38γ）亞基的表達(dá)情況；以腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)構(gòu)建SiRNA(small/short interfering RNA)載體，直接心肌內(nèi)注射下調(diào)心肌內(nèi) p38α、p

3、38γ表達(dá)。冰凍切片觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)情況，Q-PCR、Western-blot測定p38α， p38γ表達(dá)降低情況；將上述模型結(jié)合，動脈導(dǎo)管技術(shù)檢測各組心功能變化，測量左室內(nèi)壓上升/下降最大速率（± Maximal rate of left ventricular pressure development，±LVdp/dt max，），左室舒張末壓（Left ventri

4、cular end-diastolic pressure，LVEDP），左室收縮壓（Left ventricularsystolic pressure，LVSP）；Western-blot檢測胞膜上和胞漿內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glucose transporter1,GLUT-1)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter4,GLUT-4)，脂肪酸轉(zhuǎn)位蛋白FAT/CD36的表達(dá)；間接免疫熒光測定胞膜和胞漿內(nèi)GLUT-1，G

5、LUT-4，F(xiàn)AT/CD36的表達(dá)。
　　結(jié)果：①I/R可增加心肌細(xì)胞內(nèi)p38γ表達(dá)，Exenatide預(yù)處理可增強(qiáng)此效應(yīng)（P＜0.05），單獨(dú)使用Exenatide不能增加p38γ表達(dá)。p38α表達(dá)水平無變化。②冰凍切片可見到均勻明亮的綠色熒光；與AAV-GFP組相比，AAV-p38α組的p38α亞基在mRNA、蛋白水平顯著降低，p38γ亞基表達(dá)水平無變化；AAV-p38γ組的p38γ亞基在mRNA、蛋白水平顯著降低（P＜0.0

6、5），p38α亞基表達(dá)水平無變化；③ Exenatide預(yù)處理改善了I/R對心肌的損傷，表現(xiàn)為：±LV dp/dt max、LVSP增加， LVEDP降低（P＜0.05）；該保護(hù)效應(yīng)在AAV-GFP、AAV-p38α組存在， AAV-p38γ組消失了（P＜0.05）;④和I/R組相比，Exenatide預(yù)處理增加了心肌細(xì)胞膜上的 GLUT-1表達(dá)，且在胞漿內(nèi)的表達(dá)也增加了；該效應(yīng)在AAV-GFP、AAV-p38α組存在，AAV-p38γ

7、組消失了（P＜0.05）;⑤和I/R組相比，Exenatide預(yù)處理增加了心肌細(xì)胞膜上的GLUT-4向胞漿內(nèi)易位，該效應(yīng)在 AAV-GFP、AAV-p38α組存在，AAV-p38γ組消失了（P＜0.05）;⑥和I/R組相比，Exenatide預(yù)處理顯著增加了心肌細(xì)胞膜上的FAT/CD36向心肌細(xì)胞胞漿的易位；該效應(yīng)在AAV-GFP、AAV-p38α組存在，AAV-p38γ組消失了（P＜0.05）;⑦間接免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，表現(xiàn)

8、為：Sham組中GLUT-1在細(xì)胞膜上有微弱表達(dá)，I/R后膜上紅色熒光增強(qiáng)，Exenatide預(yù)處理增加了這一效應(yīng)，且伴胞內(nèi)的紅色熒光表達(dá)增加;GLUT-4在Sham組中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，I/R后細(xì)胞膜上紅色熒光顯著增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色熒光顯著減少，而Exenatide預(yù)處理增加了這一效應(yīng);FAT/CD36在Sham組中強(qiáng)烈表達(dá)于細(xì)胞膜上，I/R后細(xì)胞膜上紅色熒光減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色熒光增加，而Exenatide預(yù)處理增加了這一效應(yīng)。以上

9、效應(yīng)在AAV-p38α、AAV-GFP組中依然存在，但在AAV-p38γ組中消失了
　　結(jié)論：①I/R及聯(lián)合使用Exenatide可增加正常SD大鼠心肌內(nèi)p38γ蛋白表達(dá)，但單獨(dú)使用Exenatide無此效應(yīng)；②心肌內(nèi)直接注射AAV可有效下調(diào)p38α和p38γ基因表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)動物基因表達(dá)調(diào)節(jié)的良好工具；③Exenatide可優(yōu)化正常大鼠心臟 I/R后能量代謝底物的選擇；④對能量代謝底物選擇的優(yōu)化可改善正常大鼠心臟I/R后左心功能；

10、⑤p38γMAPK信號途徑在這一調(diào)節(jié)效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。
　　第二部分Exenatide對2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代謝模式的影響
　　目的：探討Exenatide對2型糖尿病大鼠心肌I/R時(shí)心功能及細(xì)胞膜上Glu、FFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體、細(xì)胞內(nèi)能量代謝酶及代謝底物的影響。
　　方法：建立2型糖尿?。═2DM）模型，不同劑量（3、6、10ug/kg） Exenatide處理3周，觀察其體重及血糖變化，篩選出降低血糖且不

11、影響體重變化的劑量;Exenatide預(yù)處理后建立I/R模型，動脈導(dǎo)管技術(shù)檢測左心功能；小動物PETCT檢測心臟Glu攝入量；Western-blot測定膜上GLUT-1，GLUT-4, FAT/CD36，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（monocarboxylate transporter1，MCT-1）水平;ELISA測定心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝相關(guān)酶及FFA水平：中鏈酰基輔酶 A脫氫酶（ Medium ChainAcyl-CoA Dehydroge

12、nase， MCAD）、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（ Carnitine palmityl transferaseⅠ，CPT-1）、6-磷酸果糖激酶-1（6-phosphofructokinase1， PFK-1）;蒽醌法測定糖原（glycogen，Gn）水平。
　　結(jié)果：①和saline組相比，Exenatide6 ug/kg可降低血糖水平（P＜0.05），且不伴明顯體重變化，以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的適宜用藥劑量；②與DM組相比， Exenat

13、ide預(yù)處理改善糖尿病大鼠心功能，表現(xiàn)為± LV dp/dt max、LVSP的增加及LVEDP的減少；與DM+I/R組相比， Exenatide預(yù)處理組心功能有所改善，表現(xiàn)為±LV dp/dt max、LVSP的增加及LVEDP的減少（P＜0.05）；③與DM組相比，Exenatide預(yù)處理提高了糖尿病大鼠心臟葡萄糖攝入量，對I/R后的心臟葡萄糖攝入也有顯著提高作用（P＜0.05）；④與DM組相比，Exenatide預(yù)處理可促進(jìn)心肌細(xì)

14、胞膜上GLUT-1，GLUT-4表達(dá)，抑制FAT/CD36表達(dá)；與DM+I/R組相比， Exenatide預(yù)處理還增加了 I/R后膜上的 GLUT-1，GLUT-4表達(dá)，抑制FAT/CD36表達(dá)（P＜0.05）；⑤與DM組相比， Exenatide預(yù)處理未能促進(jìn)心肌細(xì)胞膜上的乳酸轉(zhuǎn)移載體MCT-1表達(dá)（P＞0.05），但與DM+I/R組相比，增加了I/R后膜上的MCT-1表達(dá)（P＜0.05）；⑥與DM組相比，Exenatide預(yù)處理抑制

15、了心肌細(xì)胞內(nèi)FFA代謝的關(guān)鍵酶CPT-1和MCAD表達(dá)（P＜0.05）；與DM+I/R組相比，Exenatide預(yù)處理增加了I/R后胞內(nèi)的PFK-1表達(dá)，抑制了CPT-1和MCAD表達(dá)（P＜0.05）；⑧與DM組相比， Exenatide預(yù)處理降低了心肌細(xì)胞內(nèi)的Gn和FFA蓄積；與DM+I/R組相比，Exenatide預(yù)處理降低了I/R后心肌細(xì)胞內(nèi)的Gn和FFA蓄積（P＜0.05）。
　　結(jié)論：①Exenatide預(yù)處理正向調(diào)節(jié)T

16、2DM大鼠心臟Glu代謝：增加心臟 Glu攝入量；促進(jìn) GLUT-4、GLUT-1向胞膜易位；降低了 Gn的蓄積；③Exenatide預(yù)處理負(fù)向調(diào)節(jié)T2DM大鼠心肌細(xì)胞FFA代謝：促進(jìn)FAT/CD36向胞內(nèi)易位，降低了CPT-1、MCAD-1表達(dá)和FFA蓄積；④除此之外，Exenatide預(yù)處理還促進(jìn)T2DM大鼠I/R損傷后細(xì)胞內(nèi)PFK-1活性及膜上CPT-1表達(dá)，增加糖酵解的同時(shí)增加乳酸鹽外排，降低 I/R時(shí)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的 PH值；⑤能

17、量模式的雙重調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)了對T2DM大鼠I/R時(shí)心臟功能的保護(hù)作用。
　　第三部分Exenatide調(diào)節(jié)糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代謝模式的機(jī)制
　　目的：探討Exenatide對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時(shí)能量代謝模式調(diào)節(jié)的機(jī)制。
　　方法：建立T2DM模型。心肌內(nèi)直接注射AAV，下調(diào)p38α，p38γ亞基表達(dá)。6 ug/kg Exenatide預(yù)處理后建立I/R模型。動脈導(dǎo)管技術(shù)檢測左心功能；小動物 PETCT檢測心

18、臟葡萄糖攝入量；Western-blot測定Glu轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT-1，GLUT-4,脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 FAT/CD36，乳酸轉(zhuǎn)移蛋白 MCT-1水平; ELISA測定心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝相關(guān)酶（CPT-1、MCAD、PFK-1）及 FFA水平;蒽醌法測定心肌細(xì)胞內(nèi) Gn水平。
　　結(jié)果：①與 DM+I/R+Exenatide組相比， Exenatide預(yù)處理對AAV-p38MAPKα及AAV-GFP組心功能仍有改善作用，但這一作用在

19、AAV-p38MAPKγ組消失了（P＜0.05）；②與 DM+I/R+Exenatide組相比，Exenatide預(yù)處理增加了AAV-p38MAPKα及AAV-GFP組I/R損傷后心臟 Glu攝入量，但這一作用在 AAV-p38MAPKγ組消失了（P＜0.05）；③與 DM+I/R+Exenatide組相比， Exenatide預(yù)處理增加了AAV-p38MAPKα及 AAV-GFP組 I/R后心肌細(xì)胞膜上的 GLUT-1， GLUT-4

20、, MCT-1表達(dá)，抑制了 FAT/CD36表達(dá)，但這一作用在AAV-p38MAPKγ組消失了（P＜0.05）；④與 DM+I/R+Exenatide組相比，Exenatide預(yù)處理增加了AAV-p38MAPKα及AAV-GFP組I/R后心肌細(xì)胞內(nèi) PFK-1表達(dá)，抑制了 CPT-1，MCAD表達(dá)，但這一作用在AAV-p38MAPKγ組消失了（P＜0.05）；⑥與 DM+I/R+Exenatide組相比，Exenatide預(yù)處理減少了A