p16表達下調(diào)對hUC-MSCs和APP+鼠的抗衰老作用.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是以進行性認知功能障礙和行為損害為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，具體表現(xiàn)為記憶能力降低、執(zhí)行能力降低等行為的改變。隨著年齡的增加，AD的發(fā)病率也逐年增加，目前我國正面臨日趨嚴重的人口老齡化問題，60歲以上老人達到2.1億。因此，尋求 AD有效的防治療法是亟待解決的重大問題。人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）是一類具有高度自我更新和分化潛能的成體干細胞，來源于臍帶沃頓膠（

2、Wharton’s Jelly）組織，具有來源廣泛、低免疫反應(yīng)、使用安全可靠、無倫理爭議以及體外易于培養(yǎng)等特點，是組織工程和干細胞替代療法的種子細胞,為AD治療帶來希望。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植治療AD可以改善AD的學(xué)習(xí)記憶功能，延緩衰老。但是隨著傳代次數(shù)的增加，干細胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)出衰老的特征，增殖和分化能力也隨之減弱。因此，臨床和基礎(chǔ)研究多選用3-5代的干細胞進行移植，有限的細胞數(shù)量極大地限制了干細胞的使用。因此，研

3、究調(diào)控干細胞衰老的關(guān)鍵基因，改善干細胞微環(huán)境是提高干細胞活性和療效的關(guān)鍵。
　　p16基因是美國冷泉實驗室Kamb等于1993年發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，同時又是細胞周期的關(guān)鍵調(diào)控基因。p16能夠阻遏周期蛋白D（cyclinD）與周期蛋白依賴性蛋白激酶4/6（CDK4/CDK6）的結(jié)合，抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤（RB）的磷酸化，而未磷酸化的RB則不能與E2F結(jié)合啟動DNA的復(fù)制，從而將細胞周期阻斷在G1/S檢查點，導(dǎo)致細胞周期停滯。課題組前期

4、研究發(fā)現(xiàn)p16基因高表達能導(dǎo)致293細胞的衰老，但是p16與hUC-MSCs和AD鼠的衰老關(guān)系還不清楚。因此，本課題通過體內(nèi)體外實驗研究p16表達下調(diào)對hUC-MSCs和APP+鼠衰老的調(diào)控。
　　目的:本研究以p16基因為切入點，以慢病毒為載體，利用RNAi技術(shù)下調(diào)P15hUC-MSCs中p16基因的表達，進而觀察p16基因表達下調(diào)對hUC-MSCs衰老的影響；同時，在體內(nèi)實驗中，以APP+鼠為研究對象，研究p16表達下調(diào)的P1

5、5 hUC-MSCs對APP+鼠的神經(jīng)修復(fù)和抗衰老作用。
　　方法:
　　1.靶向下調(diào)p16基因表達的siRNA片段的篩選和慢病毒構(gòu)建
　　取剖腹產(chǎn)健康新生兒臍帶，體外分離培養(yǎng) hUC-MSCs，流式細胞儀檢測hUC-MSCs細胞表面標記物CD44、CD90、CD34和CD45的表達，收集3、10、15代的細胞，qRT-PCR檢測p16的表達，β-半乳糖苷酶染色檢測不同代數(shù)hUC-MSCs的衰老程度。篩選有效下調(diào)p16

6、基因表達的siRNA（sip16），構(gòu)建包含sip16的慢病毒(LV-shp16)，LV-shp16感染hUC-MSCs觀察綠色熒光表達以及檢測P16蛋白表達。
　　2.p16基因表達下調(diào)對hUC-MSCs衰老的影響
　　體外實驗分為四組，分別為P3組、P15組、LV組和LV-shp16組。CCK-8法檢測各組細胞的增殖；PI染色和FITC染色檢測各組細胞的周期和凋亡；β-半乳糖苷酶染色檢測各組細胞的衰老狀態(tài)；qRT-PCR

7、和Western blot檢測各組細胞中細胞周期關(guān)鍵基因（CDK4、CDK6、RB1、p-RB1）以及衰老相關(guān)基因（p16、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2）的表達變化。
　　3.p16表達下調(diào)的hUC-MSCs對APP+鼠神經(jīng)功能的修復(fù)作用
　　體內(nèi)實驗中，取4月齡APP+雄鼠40只，隨機分為5組，分別為P3hUC-MSCs移植組（P3組）、空白組（AD組）、P15 hUC-MSCs移植組（P15組）、LV

8、感染的P15 hUC-MSCs移植組（LV組）、LV-shp16感染的P15 hUC-MSCs移植組（LV-shp16組），同時以遺傳背景相同的非轉(zhuǎn)基因的野生鼠作為正常對照組（WT組）。P3組、P15組、LV組、LV-shp16組均采用尾靜脈注射hUC-MSCs的方式治療，每只APP+鼠注射細胞量為1X106個cell/200ul，每周注射一次，連續(xù)注射四周，其余各組注射生理鹽水。細胞移植28天后，Morris水迷宮實驗檢測小鼠行為學(xué)的

9、改變；心臟取血，TBA法和羥胺法檢測小鼠血清中丙二醛（Malondialdehyd，MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活力變化；免疫組化檢測小鼠腦組織MAB1281的表達，檢測雙腎上腺皮脂激素（DCX）、βⅢ微管蛋白（βⅢ-Tubulin）以及淀粉樣前體蛋白（APP）的表達；提取小鼠海馬組織RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot檢測細胞周期關(guān)鍵基因(CDK4、CDK6、RB1、

10、p-RB1)、衰老相關(guān)基因(p16、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2)、凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、Bcl-2)以及Tau、p-Tau的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1、隨著傳代次數(shù)的增加，hUC-MSCs細胞逐漸呈現(xiàn)出形態(tài)扁平化，易脫壁的特點，β-半乳糖苷酶染色發(fā)現(xiàn)陽性細胞率明顯增加(P<0.05)；qRT-PCR結(jié)果顯示P3、P10、P15hUC-MSCs中p16 mRNA的表達逐漸增加(P<0.05

11、)。
　　2、成功篩選出能有效下調(diào)p16表達的siRNA，合成包含此siRNA的慢病毒并成功感染hUC-MSCs；與P15組相比，LV-shp16能促進P15 hUC-MSCs的增殖、促使細胞周期進入S期、抑制P15hUC-MSCs的早期凋亡、降低hUC-MSCs的衰老程度(P<0.05)；同時，LV-shp16組中p16、p53、p21 mRNA和蛋白表達降低，RB1 mRNA和蛋白表達不變，而pCNA、sirt1、sirt2、

12、CDK4、CDK6、p-RB1 mRNA和蛋白表達升高(P<0.05)。
　　3、細胞移植期間，APP+鼠生長狀態(tài)良好，無不良反應(yīng)；與AD組相比，各處理組均有一定的抗衰老作用；與P15組相比，LV-shp16組小鼠逃避潛伏期減少、逃避潛伏期距離縮短，穿越平臺次數(shù)、第一象限停留時間增加(P<0.05)；LV-shp16組血清SOD活力升高，MDA活力降低(P<0.05)；LV-shp16組海馬組織中p16、p53、p21、Caspa

13、se-3、p-Tau蛋白表達降低，pCNA、sirt1、sirt2、CDK4、CDK6、p-RB1、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，RB1、Tau蛋白表達變化不明顯；此外，LV-shp16組腦組織中 MAB1281陽性細胞明顯增多，DCX、βⅢ-Tubulin的表達增加，而APP的表達減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、隨著細胞傳代次數(shù)的增加，hUC-MSCs開始出現(xiàn)衰老，p16的表達與衰老呈正相關(guān)。

14、　　2、下調(diào)P15 hUC-MSCs中 p16基因的表達能調(diào)節(jié)細胞周期關(guān)鍵基因(CDK4、CDK6、p-RB1)以及衰老相關(guān)基因(p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2)的表達，延緩和改善hUC-MSCs的衰老，促進hUC-MSCs的增殖。
　　3、通過調(diào)節(jié)CDK4、CDK6、p-RB1、p53、p21、pCNA、sirt1、sirt2等基因的表達,LV-shp16能促進hUC-MSCs的遷移和神經(jīng)分化、抑制神經(jīng)細胞凋亡