Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2促進(jìn)α-干擾素誘導(dǎo)的Jak-Stat1信號(hào)通路從而抑制呼吸道合胞病毒復(fù)制.pdf

1、研究背景:
　　呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是引起嬰幼兒呼吸道感染最主要的病原體。嬰幼兒住院病例中約有40％-50％的毛細(xì)支氣管炎和25％的肺炎是由RSV感染所致。非高危人群感染RSV可僅引起普通感冒，但亦有小部分(0.5-2％)發(fā)展為嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎和肺炎;嬰兒期嚴(yán)重RSV感染與少年期哮喘發(fā)生密切相關(guān)。由于RSV致病機(jī)制尚未闡明，目前尚無(wú)有效藥物、疫苗問(wèn)世。治療和預(yù)防RSV感

2、染導(dǎo)致的疾病的難點(diǎn)在于RSV在與宿主斗爭(zhēng)過(guò)程中進(jìn)化出了多種免疫逃避機(jī)制，包括抑制T細(xì)胞增殖作用，抑制DC細(xì)胞活化和功能，RSV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2可以抑制IFN-α產(chǎn)生和發(fā)揮抗病毒作用。
　　酪氨酸激酶的磷酸化作用與酪氨酸磷酸酶的去磷酸化作用是生物體內(nèi)普遍存在的調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的重要作用方式，它們共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平。Src同源磷酸酪氨酸磷酸酶2(Src homology phospho-tyrosylp

3、hosphatase2，SHP2)是起去磷酸化作用的一種非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2是PTPs家族中的一員，它廣泛的表達(dá)在人體各種組織和細(xì)胞中，由基因PTPN11編碼，其N末端含有2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域。SHP2可以通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合磷酸酪氨酸，由于構(gòu)象的改變使其自身結(jié)構(gòu)中的酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP酶）激活，對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)分子發(fā)揮去磷酸化的作用，故SHP2對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子具有重要的調(diào)控作用。
　　干擾素（interferon

4、，IFN）是由病毒或其他激活劑刺激宿主細(xì)胞所分泌的一類細(xì)胞因子，具有廣譜的抗病毒作用。IFN通過(guò)與其相應(yīng)的受體結(jié)合，激活Jak/Stat(janus kinase，Jak; signal transducer and activator of transcription，Stat)信號(hào)通路，該信號(hào)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大作用，最終引發(fā)各類抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而發(fā)揮其抗病毒作用。關(guān)于RSV與IFN之間的相關(guān)性研究，目前已知RSV

5、可通過(guò)其非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structual protein，NS)干擾宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN，但是否與IFN的效應(yīng)階段有關(guān)，目前尚未明確。IFN誘導(dǎo)活化的信號(hào)傳遞過(guò)程受三類重要的蛋白家族調(diào)控，分別是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatases，PTPs)、細(xì)胞因子信號(hào)抑制物家族(Suppressor of cytokine signaling，SOCSs)和活化的STAT轉(zhuǎn)錄活性抑制蛋白家族（prot

6、ein inhibitor of activated STAT，PIAS）。這三大蛋白家族主要作用為負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以防止信號(hào)通路的過(guò)度激活。在IFN相關(guān)調(diào)控中，SHP2被證明是一種具有雙重功能的蛋白，既可直接負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)通路起到負(fù)調(diào)控作用，亦可通過(guò)干擾信號(hào)通路中其它調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用起到間接正向調(diào)控作用。然而，SHP2在RSV感染中的作用以及相關(guān)機(jī)制還有待研究。
　　研究目的:
　　研究SHP2在RSV感染中的作

7、用及其相關(guān)的機(jī)制，為RSV致病機(jī)制尤其是RSV免疫逃逸機(jī)制研究提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　　1.1以RSV感染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549為模型，通過(guò)RT-qPCR以及Westernblot分別檢測(cè)Shp2基因及蛋白表達(dá);以特異性化學(xué)抑制劑PHPS1(phenylhydrazono pyrazolone sulfonate1)抑制細(xì)胞內(nèi)SHP2的功能，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F蛋白表

8、達(dá)和病毒空斑形成實(shí)驗(yàn)(Plaque assay)檢測(cè)RSV成熟病毒顆粒數(shù)量來(lái)明確RSV的復(fù)制情況;通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)SHP2對(duì)RSV感染后IFN-α產(chǎn)生的影響;以外源性IFN-α事先激活細(xì)胞Jak/Stat信號(hào)通路，用PHPS1抑制SHP2功能，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F的表達(dá)以及檢測(cè)IFN-α下游的效應(yīng)分子2'，5'-OAS1的表達(dá)來(lái)明確SHP2對(duì)RSV復(fù)制的影響和IFN-α信號(hào)通路的影響;通過(guò)Western bl

9、ot檢測(cè)Jak/Stat信號(hào)通路中Jak1和Stat1磷酸化水平的變化。
　　1.2以RSV感染SHP2敲除的腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞，研究SHP2對(duì)免疫細(xì)胞中病毒復(fù)制的直接影響，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F蛋白的表達(dá)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　以RSV經(jīng)滴鼻感染野生型C57BL/6小鼠以及巨噬細(xì)胞特異性SHP2基因敲除小鼠，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)RSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白F蛋白的表達(dá)和炎癥因子IL-4

10、等的表達(dá)，肺組織HE檢測(cè)肺部的炎癥情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.RSV感染12小時(shí)后，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中SHP2的蛋白表達(dá)水平明顯增高。
　　2.以特異性SHP2抑制劑PHPS1預(yù)處理A549細(xì)胞，RSV感染后，病毒RSV-F的表達(dá)以及細(xì)胞表達(dá)IFN-α的未受影響。
　　3.先后以IFN-α、PHPS1預(yù)處理A549細(xì)胞，RSV感染后，病毒RSV-F的表達(dá)以及成熟病毒顆粒的釋放均增加;與之相對(duì)應(yīng)細(xì)胞內(nèi)

11、Jak/Stat1信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子Stat1的磷酸化水平受到抑制、Jak/Stat1信號(hào)通路誘導(dǎo)活化的抗病毒蛋白2'，5'-OAS1的表達(dá)明顯下降。
　　4.RSV感染從巨噬細(xì)胞特異性SHP2基因敲除小鼠體內(nèi)分離的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞BMM/以及腹腔巨噬細(xì)胞PM，與野生型小鼠來(lái)源的細(xì)胞相比，病毒RSV-F表達(dá)水平升高。
　　5.RSV感染單核細(xì)胞特異性SHP2基因敲除小鼠，與野生型小鼠相比，病毒在肺組織內(nèi)RSV-F蛋白表達(dá)

12、無(wú)明顯差異;小鼠肺炎的病理改變以及肺內(nèi)炎癥因子的表達(dá)均沒(méi)有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.RSV感染的上皮細(xì)胞中，SHP2對(duì)IFN-α產(chǎn)生無(wú)影響，但對(duì)IFN-α效應(yīng)起正向調(diào)控作用;SHP2可促進(jìn)α-干擾素誘導(dǎo)的Jak/Stat1信號(hào)通路從而抑制RSV的復(fù)制。
　　2.在RSV感染的巨噬細(xì)胞中，SHP2直接抑制RSV的復(fù)制。僅在小鼠的單核細(xì)胞中敲除SHP2對(duì)RSV復(fù)制沒(méi)有影響。提示SHP2在巨噬細(xì)胞中可能起到與上皮細(xì)胞不