一種南極真菌來(lái)源的ETP類化合物HDN-1抗白血病作用與機(jī)制研究.pdf

1、急性髓細(xì)胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)是一種血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，主要特征為細(xì)胞增殖過(guò)度和分化受阻。根據(jù)細(xì)胞中特殊的基因遺傳學(xué)改變及細(xì)胞不同分化階段可分為M0～M7八個(gè)亞型。其中急性髓細(xì)胞部分成熟型白血病和急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)分別屬于M2和M3型。
　　目前，對(duì)于如何治療白血病患者提高其完全緩解率和無(wú)病生存期仍然是研究的熱點(diǎn)。雖然分子靶向治療取得很大進(jìn)展，但臨床上逐漸出現(xiàn)了耐藥

2、性，并且耐藥機(jī)制仍未明確。全反式維甲酸(ATRA)通過(guò)誘導(dǎo)APL細(xì)胞發(fā)生分化，取得了顯著的治療效果，但治療過(guò)程中伴隨著并發(fā)癥的發(fā)生。因此，對(duì)于急性髓系白血病治療的探索仍然是一個(gè)艱巨的任務(wù)。
　　HDN-1是從南極來(lái)源的真菌Oidiodendron truncatum GW3-13中提取獲得的含有硫橋結(jié)構(gòu)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的多硫代二酮哌嗪類(ETPs)化合物。實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)HDN-1能跟熱休克蛋白Hsp90-C端結(jié)合，引起顧

3、客蛋白的降解。在此基礎(chǔ)上，本文系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了HDN-1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)HDN-1對(duì)急性髓細(xì)胞部分成熟型白血病細(xì)胞HL-60抑制效果最為顯著，因此，本文進(jìn)一步在體外細(xì)胞水平和體內(nèi)動(dòng)物水平對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　一、HDN-1誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡
　　1、MTT法檢測(cè)HDN-1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明，HDN-1對(duì)肝癌，肺癌，乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50值在0.03μm

4、ol·L-1～3μmol·L-1范圍內(nèi)，對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的作用最強(qiáng)，IC50值為38 nmol·L-1。小鼠免疫細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HDN-1對(duì)正常的淋巴免疫細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)抑制作用。說(shuō)明HDN-1在體外具有廣泛的抗腫瘤活性，對(duì)HL-60細(xì)胞尤為敏感，并且有一定的細(xì)胞選擇性，不影響機(jī)體免疫細(xì)胞活力與T、B細(xì)胞的免疫功能。
　　2、Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)凋亡小體濃染

5、?；蚪MDNA瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)HDN-1將HL-60細(xì)胞的DNA切割成倍于180～200bp大小的DNA片段，表明HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡。采用蛋白印跡法(Western Blotting)對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)一步探究，結(jié)果顯示，不同濃度的HDN-1作用HL-60細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、PARP等凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)剪切條帶，Caspase特異性的抑制劑可以恢復(fù)H

6、DN-1抑制的HL-60細(xì)胞增殖，恢復(fù)率可達(dá)50％～90％。說(shuō)明HDN-1誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生依賴Caspase途徑的凋亡。在HDN-1作用的HL-60細(xì)胞中，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增多，凋亡抑制蛋白Bcl-2、Mcl-1表達(dá)減少，DNA斷裂標(biāo)志性蛋白γ-H2AX表達(dá)量增多。說(shuō)明，HDN-1誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡是通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑共同完成的。
　　二、HDN-1誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化
　　1、吉姆薩染色結(jié)果

7、顯示，HDN-1能夠改變HL-60細(xì)胞核形態(tài)，降低核質(zhì)比，細(xì)胞核逐漸變?yōu)槟I形和分葉核狀。通過(guò)過(guò)糖原染色(PAS)過(guò)碘酸-雪夫氏反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)糖原變化發(fā)現(xiàn)，HDN-1時(shí)間劑量依賴性的增加HL-60細(xì)胞內(nèi)PAS陽(yáng)性率，提示HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生分化。
　　2、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HDN-1可以誘導(dǎo)粒細(xì)胞表面抗原CD11b和髓系白血病特異標(biāo)志抗原CD13的表達(dá)量增高，呈CD13hi/CD11b+的

8、變化趨勢(shì)，而單核細(xì)胞特異抗原CD14未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明HDN-1誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生分化是向著成熟粒細(xì)胞方向進(jìn)行的。
　　3、通過(guò)吉姆薩染色和PAS染色比較了HDN-1與全反式維甲酸(ATRA)對(duì)HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用。染色和統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，HDN-1可以在更短的時(shí)間，更低的濃度下誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生分化。說(shuō)明，HDN-1比ATRA在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化方面更有優(yōu)勢(shì)。
　　4、聯(lián)合HDN-1與ATRA共同作用于H

9、L-60細(xì)胞，聯(lián)合指數(shù)CI=0.51＜1，等效線圖解法分析結(jié)果表明，兩種化合物聯(lián)用的多個(gè)IC50值均位于等效線的左下方，說(shuō)明HDN-1與ATRA聯(lián)合對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制是協(xié)同作用。
　　三、HDN-1的體內(nèi)藥效學(xué)研究
　　本部分實(shí)驗(yàn)成功建立了急性髓細(xì)胞白血病部分成熟型細(xì)胞HL-60的NOD-SCID小鼠皮下異種植瘤模型，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，設(shè)置空白組、溶劑組、HDN-1高、低劑量組(1mg/kg，0.5mg/kg)，

10、靜脈注射，連續(xù)給藥12天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HDN-1高、低兩個(gè)劑量的抑瘤率分別是18％和46％，說(shuō)明HDN-1可以抑制HL-60移植瘤的生長(zhǎng)，且對(duì)小鼠體重的影響較小。
　　四、HDN-1對(duì)HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化和凋亡的機(jī)制研究
　　(1) Hsp90發(fā)揮分子伴侶作用需要輔分子伴侶的存在，Hsp70是Hsp90重要的共分子伴侶之一，Hsp70能與Hsp90-C端結(jié)合，形成蛋白修飾復(fù)合體，行使Hsp90分子伴侶的功能。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)

11、免疫共沉淀方法考察了HDN-1對(duì)HL-60細(xì)胞內(nèi)Hsp90與Hsp70的結(jié)合情況，證實(shí)HDN-1可以抑制Hsp90與Hsp70的結(jié)合，說(shuō)明HDN-1在白血病細(xì)胞中仍然與Hsp90-C端相結(jié)合，抑制Hsp90加工顧客蛋白的功能。
　　(2)存在于白血病中的Hsp90顧客蛋白很多，為進(jìn)一步考察HDN-1抗白血病的機(jī)制，通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)了白血病細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡分化相關(guān)的Hsp90顧客蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明HDN-1引起

12、了細(xì)胞中Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、CyclinD1、Bcr-Abl、Stat3、p-Stat3等蛋白的降解和活性抑制，從而使得下游信號(hào)分子發(fā)生改變，提示這可能是HDN-1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡和分化的機(jī)制。
　　綜上所述，HDN-1具有廣譜的抗腫瘤活性，對(duì)于急性髓性白血病細(xì)胞HL-60作用尤為敏感，HDN-1與ATRA聯(lián)用對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖作用更強(qiáng)，兩種化合物表現(xiàn)為協(xié)同作用。HDN-1可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)

13、生凋亡和成熟粒細(xì)胞方向的分化，這是首次發(fā)現(xiàn)ETP類化合物能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，并且與ATRA進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HDN-1能夠在更短的時(shí)間更低的濃度下誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化。HDN-1在動(dòng)物體內(nèi)可以顯著抑制小鼠HL-60白血病皮下移植瘤的生長(zhǎng)，而HDN-1對(duì)于白血病的抑制可能是通過(guò)與Hsp90相結(jié)合抑制Hsp90顧客蛋白中與分化凋亡相關(guān)的蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這為今后進(jìn)一步研究HDN-1的抗白血病機(jī)制提供了有效的數(shù)據(jù)依據(jù)，為ETP類化合物的成藥