新型CA-4類化合物MZ3的抗白血病作用與其機(jī)制研究.pdf

1、目的：評(píng)價(jià)新型CA-4類化合物MZ3對(duì)白血病體內(nèi)與體外的抑制作用，研究MZ3的抗白血病作用機(jī)制。 方法：采用MTT法評(píng)價(jià)MZ3體外抑制六種人白血病細(xì)胞(NB4，Molt-4，HL60，K562和耐藥細(xì)胞株HL6OR，K562R)的活性，測(cè)定MZ3對(duì)這六株細(xì)胞的IC50值：采用荷HL60人白血病細(xì)胞的SCID小鼠模型評(píng)價(jià)MZ3體內(nèi)抗白血病活性，繪制小鼠的存活曲線，計(jì)算中位生存時(shí)間(mediam survival time，MST)

2、。采用DAPI染色觀察MZ3誘導(dǎo)K562產(chǎn)生的凋亡小體；采用DNA電泳檢測(cè)MZ3誘導(dǎo)HL60和K562細(xì)胞產(chǎn)生的DNA梯狀電泳：采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MZ3誘導(dǎo)HL60和K562細(xì)胞凋亡的作用。采用JC1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MZ3對(duì)HL60細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential，Aψm)的影響；采用Carboxy-DCFDA染色檢測(cè)MZ3對(duì)HL60細(xì)胞活性氧族(reactive oxy

3、gen species，ROS)含量的影響；采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MZ3對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響：采用免疫熒光法觀察MZ3對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的影響；采用Westem blotting檢測(cè)MZ3對(duì)HL60和K562細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3，PARP)的影響，MZ3對(duì)HL60細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白(ERKl/2，P38，JNK，p-ERK1/2，p-P38，p-JNK，Bax，Bcl-2)的影響，MZ3對(duì)K56

4、2細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白(cyclin B1，cdc2，cdc25C，Wee1，CDK7，MPM．2)和微管蛋白的影響。 結(jié)果： 1. MZ3對(duì)所選的六株白血病細(xì)胞均有較好的抑制作用，ICso值均小于8.0pM，對(duì)白血病耐藥株也呈現(xiàn)較好的抑制活性，對(duì)NB4，Molt-4，HL60和K562的IC50值分別為1.2±0.2 pM，4.2±0.4 pM，2.7±0.2 pM，3.4±0.1pM，對(duì)白血病耐藥株HL60R和K562

5、R細(xì)胞的IC50分別為3.5±0.5 pM和8.0±0.3 pM。 2.在荷HL60人白血病細(xì)胞的SCID小鼠實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組6只小鼠在接種HL60細(xì)胞后20天內(nèi)全部死亡，中位生存時(shí)間(MST)為15天：而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組和MZ3給藥組第一只小鼠死亡分別發(fā)生在第25和第26天，MST分別為26.5天和33.5天。環(huán)磷酰胺(10.0mg/kg)和MZ3(10.0mg/Kg)均可以延長(zhǎng)白血病SCID小鼠的生存時(shí)間，且MZ3效果優(yōu)于環(huán)

6、磷酰胺。 3.DAPI染色顯示，16.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h后可使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體。DNA電泳結(jié)果顯示，4.0μM，8.0 μM和16.0 μM MZ3作用HL60細(xì)胞24 h均可使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡特征性的DNA梯狀條帶；8.0μM和16 0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h可使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡特征性的DNA梯狀條帶。 4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，8.0 μM MZ3作用HL60細(xì)胞O h，6 h，12 h，24h，4

7、8h和72h均能誘導(dǎo)HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡率分別為0.9％，2.5％，14.2％，30.5％，65.5％和85.4％，呈時(shí)間依賴性關(guān)系；16.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞0 h，6 h，12 h和24 h均能誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡率分別為2.5％，2.8％，5.8％和31.3％，呈時(shí)間依賴性關(guān)系：0.0μM，4.0 μM，8.0 μM和16.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡

8、率分別為4.4％，35.0％，36.6％和31.3％K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。 5. Western blotting結(jié)果顯示，8.0 μM MZ3作用HL60細(xì)胞12 h和24 h可使細(xì)胞內(nèi)procaspase-3被切割激活，進(jìn)而水解其底物PARP，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：4.0 μM，8.0 μM和16.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h可使細(xì)胞內(nèi)procaspase-3被切割激活，進(jìn)而水解其底物PARP，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

9、 6. JCl染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(Δψm)結(jié)果顯示，8.0 pM MZ3作用HL60細(xì)胞O h，8 h，16 h和24 h可分別可使2.O％，3.O％，18.9％和48.4％HL60細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，即Δψm降低，呈時(shí)間依賴性關(guān)系。 7. Carboxy-DCFDA染色法檢測(cè)細(xì)胞ROS含量結(jié)果顯示，8.0 μM MZ3作用HL60細(xì)胞0 h，1 h，2 h，3 h和4 h后細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度分別為22.9，26.5，3

10、8.3，32.4和29.5；細(xì)胞內(nèi)ROS含量在2 h點(diǎn)升到最高，為O h點(diǎn)的1.7倍，隨后ROS含量回到給藥前水平。 8. 1.0 μM，2.0 μM，4.0 μM，8.0μM和16.0 μM MZ3與或不與ROS抑制劑NAC(200.0 uM)同時(shí)作用HL60細(xì)胞72 h后分別可抑制8.8±11.0％，59.0±8.7％，81.7±9.1％，87.1±4.2％，87.9±3.6％和17.1±5.2％，57.8±9.1％，82.

11、2±5.2％，86.7±2.8％，87.6±2.1％細(xì)胞的生長(zhǎng)。說(shuō)明NAC不能抑制MZ3的細(xì)胞毒作用。 9. Westem bIotting結(jié)果顯示，8.0μM MZ3作用HL60細(xì)胞6 h，12 h和24 h還可使細(xì)胞內(nèi)Bax呈時(shí)間依賴性遞增，BcI-2呈時(shí)間依賴性遞減，Bax/BcI-2的比例分別為2.2，15.7和28.5。80. μM MZ3作用HL60細(xì)胞6 h，12 h和24 h可使細(xì)胞內(nèi)P-ERKl，2顯著遞減，減弱ERK

12、l，2的活性，P-D38和P．JNK顯著遞增，增強(qiáng)p38和JNK的活性。說(shuō)明MZ3可通過(guò)影響HL60細(xì)胞中MAPK家族和BcI-2家族蛋白的表達(dá)和活化，激活線粒凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 10.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，16.0 uM MZ3作用K562細(xì)胞0 h，6 h，12 h，24 h分別能夠使6.1％，11.1％，31.1％和38.1％K562細(xì)胞阻滯于G2，M期，呈時(shí)間依賴性關(guān)系；0.0μM，4.0 μM，8.0μM和16

13、.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h分別能夠使10.8％，25.7％，28.2％和38.1％K562細(xì)胞阻滯于G2M期呈劑量依賴性關(guān)系。 1 1.免疫熒光結(jié)果顯示，16.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h使得許多細(xì)胞內(nèi)微管數(shù)量明顯減少。分離細(xì)胞內(nèi)可溶性的微管蛋白(即未聚合的微管蛋白)分離后，通過(guò)westem bIotting檢測(cè)，結(jié)果顯示1.0μM，2.0μM，4.0μM，8.0μM和16.0 μM MZ3作用K56

14、2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)的可溶性微管蛋白含量呈劑量依賴性增加，暗示著細(xì)胞內(nèi)聚集狀態(tài)的微管蛋白有所減少。說(shuō)明MZ3也可通過(guò)影響K562細(xì)胞中微管蛋白的聚合，導(dǎo)致K562細(xì)胞阻滯于G2M。 12.Westem bIoting結(jié)果顯示，4.0μM，8.0μM和16.0 μM MZ3作用K562細(xì)胞24 h后使得細(xì)胞內(nèi)cycIin B1和MPM-2水平升高，cdc2c和dc25C水平降低，Weel活性增加。說(shuō)明MZ3可通過(guò)影響K562細(xì)