鹽酸小檗堿對非酒精性脂肪性肝病大鼠腸道菌群影響的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是我國常見的慢性肝臟疾病之一，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)及肝硬化和肝細(xì)胞癌。NAFLD發(fā)生與高脂飲食、缺乏鍛煉等不良的生活方式有關(guān)。有研究證實(shí)，高脂飲食誘導(dǎo)形成的NA

2、FLD存在腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，腸黏膜屏障功能受損。近年來，“肝-腸軸”學(xué)說、“多重打擊學(xué)說”為尋找肝病的發(fā)病機(jī)制和診療方法提供了新思路。
　　鹽酸小檗堿（berberine，BBR）是從黃連、黃柏、三顆針中提取的異喹林生物堿，鹽酸小檗堿具有廣譜的抑菌作用，臨床上主要作為非處方藥治療胃腸道炎癥和細(xì)菌性痢疾。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿有著改善胰島素抵抗、治療代謝綜合征、降低膽固醇等作用。有研究證實(shí)鹽酸小檗堿能改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而能

3、改善疾病的狀態(tài)。本研究探討鹽酸小檗堿是否能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)改善腸黏膜屏障功能，從而達(dá)到治療NAFLD的目的。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食建造NAFLD大鼠模型，研究鹽酸小檗堿通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)對NAFLD大鼠腸黏膜屏障起到保護(hù)作用，為鹽酸小檗堿治療NAFLD提供理論依據(jù)。
　　方法：健康清潔級雄性SD大鼠33只(200g±10g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：正常對照組(normal control group，

4、簡稱N組)、高脂模型組(high diet model group，簡稱M組)、鹽酸小檗堿組(berberine group，簡稱B組)，每組11只。其中，N組給予普通飼料喂養(yǎng)，M組及B組給予高脂飼料（脂肪含量59.8％）喂養(yǎng)，普通飼料及高脂飼料原材料均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。各組喂養(yǎng)12周后，每組處死1只，HE染色觀察肝細(xì)胞脂肪沉積程度確定造模成功。造模成功后，N組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，M組、B組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；B組給予15

5、0mg/(kg.d)鹽酸小檗堿2ml灌胃，N組與M組給予等量的生理鹽水灌胃，治療過程中根據(jù)大鼠體重的變化調(diào)整用藥量，連續(xù)灌胃4周后，即喂養(yǎng)16周后，隔夜禁食，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血，測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、內(nèi)毒素（Endotoxin）、D-乳酸、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）水平；留取肝臟組織標(biāo)本，HE染色觀察肝臟病理學(xué)變化；取回腸末端腸組織行HE染色和掃描電鏡

6、觀察腸黏膜絨毛的變化，透射電鏡觀察腸黏膜緊密連接的變化，留取大鼠新鮮糞便行高通量測序技術(shù)研究腸道菌群的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠喂養(yǎng)12周時M組、B組大鼠體重較N組大鼠體重明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；M組和B組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HE染色結(jié)果顯示M組、B組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪沉積，證明造模成功；
　　2.大鼠喂養(yǎng)16周時，即鹽酸小檗堿干預(yù)4周后，M組大鼠的體重較N組大鼠的

7、的體重明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組大鼠相比， B組大鼠體重有所下降，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　3.大鼠血液指標(biāo)結(jié)果：M組ALT、AST、TC、TG較N組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比，B組大鼠血清ALT、AST、TC、TG明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。M組大鼠內(nèi)毒素、D-乳酸、I-FABP較N組大鼠顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組相

8、比， B組內(nèi)毒素、D-乳酸、I-FABP有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　4.肝臟組織HE染色：與N組大鼠相比，M組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞排列不齊，肝細(xì)胞腫大，肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不等的脂肪空泡，可見細(xì)胞核被擠向一邊。經(jīng)鹽酸小檗堿治療后B組大鼠肝細(xì)胞腫脹程度減輕，脂肪空泡較少，肝細(xì)胞排列較整齊；
　　5.腸組織HE染色：N組大鼠腸絨毛排列緊密，結(jié)構(gòu)完整；M組腸絨毛變短、稀疏，局部有絨毛脫落；與M組相比，B組腸

9、絨毛輕度水腫，排列較整齊、緊密；
　　6.腸黏膜掃描電鏡結(jié)果：N組大鼠腸絨毛呈寬厚的葉片狀，排列緊密、整齊。M組大鼠可見腸絨毛呈扁平狀，排列稀疏，局部絨毛有斷裂、倒伏。與M組相比，B組大鼠腸絨毛形態(tài)較飽滿，排列比較緊密、整齊；
　　7.腸黏膜透射電鏡結(jié)果：N組透射電鏡下腸黏膜上皮細(xì)胞間靠腔面緊密連接比較長，結(jié)構(gòu)清晰，連接縫隙??；M組腸黏膜上皮細(xì)胞間靠腔面緊密連接消失，連接縫隙增大；B組腸黏膜上皮細(xì)胞間靠腔面緊密連接存在，連接

10、縫隙小；
　　8.糞便菌群高通量測序結(jié)果
　　8.1.序列分析結(jié)果
　　M組Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)與N組相比有增高的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)均低于N、M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明鹽酸小檗堿對腸道菌群結(jié)構(gòu)改變有重要作用；
　　8.2.物種累積曲線
　　本實(shí)驗(yàn)中物種累積曲線上升平緩，表明樣本量足夠，可以估計(jì)群落豐富度；
　　8.3.大鼠

11、糞便微生物的群落變化
　　在門水平，N組、M組糞便菌群主要以厚壁菌門和擬桿菌門為主，均為總體的90%以上；B組中糞便菌群中此兩種細(xì)菌比例約73%。與N組相比，M組厚壁菌門、變形菌門是增加的，擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門所占比例減少。與M組相比，B組糞便菌群中擬桿菌門、變形菌門所占比例均是增加的，而厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門是減少的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　在屬水平，N組中前20種菌屬占到整體菌屬的92.5%，M組中前20種菌屬

12、占到整體菌屬的94.3%，B組中前20種菌屬占到整體菌屬的94.8%。其中在N組中前3種優(yōu)勢菌屬分別為乳桿菌屬、普雷沃菌屬、屬于厚壁菌門中梭菌目中的未知菌屬；M組中前3中優(yōu)勢菌屬有兩種屬于厚壁菌門中梭菌目中的未知菌屬，一種屬于擬桿菌門中S24-7科中的未知菌屬；B組中前3種優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、屬于擬桿菌門中S24-7科中的未知菌屬、屬于厚壁菌門中毛螺旋科中的未知菌屬；
　　與N組相比，M組中乳桿菌屬、普雷沃菌屬豐度是降低的，M組中

13、豐度增加的菌屬包括屬于厚壁菌門中梭菌目中的未知菌屬、毛螺旋科中的未知菌屬、屬于擬桿菌門中S24-7科中的未知菌屬。與M組和N組相比， B組中擬桿菌屬豐度是增加的，而屬于擬桿菌門中S24-7科中的未知菌屬、屬于厚壁菌門中毛螺旋科中的未知菌屬豐度是降低的，與N組相比其豐度是增加的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　結(jié)合以上結(jié)果得出結(jié)論，高脂飲食能誘導(dǎo)大鼠腸道菌群發(fā)生變化，其變化主要集中于腸道各分類水平中菌群的豐度變化，對腸道中總

14、體菌群的種類改變較??；鹽酸小檗堿能降低NAFLD大鼠糞便菌群的種類，使糞便菌群中富集擬桿菌門中的擬桿菌屬，抑制屬于厚壁菌門毛螺旋科和擬桿菌門S24-7科的菌屬生長。
　　結(jié)論：
　　1.高脂飲食喂養(yǎng)能誘導(dǎo)產(chǎn)生NAFLD大鼠模型，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，損傷腸黏膜機(jī)械屏障。
　　2.鹽酸小檗堿可以改善NAFLD大鼠內(nèi)毒素血癥，降低NAFLD大鼠體重、血脂，減輕肝臟脂肪變性程度，改善肝臟功能。
　　3.鹽酸小檗堿能降低腸黏