腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞參與創(chuàng)傷性休克腸粘膜屏障功能改變的研究.pdf

1、背景：嚴(yán)重創(chuàng)傷休克常因為導(dǎo)致機體免疫功能抑制，進(jìn)而誘發(fā)全身嚴(yán)重感染、膿毒血癥(sepsis)及多臟器功能衰竭(MOF)。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重創(chuàng)傷可以改變CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡及分化平衡(Th2反應(yīng))進(jìn)而影響全身的免疫狀態(tài)，然而確切的機制尚未明確。小腸作為一個極易受到缺血-再灌注損傷的器官、最大的免疫器官，同時又接觸最大量的腸腔內(nèi)致病菌，一直以來被認(rèn)為是危重癥患者并發(fā)院內(nèi)感染及MODS的“發(fā)動機”。近年來的研究已經(jīng)聚焦在腸道相關(guān)樹

2、突狀細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞上，它們在接受缺血再灌注損傷及腸道致病菌的雙重攻擊下可通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的分化異常進(jìn)而導(dǎo)致腸道局部及全身的免疫狀態(tài)處于紊亂狀態(tài)。嚴(yán)重創(chuàng)傷休克打擊下它們將如何工作可能會成為機體遭受嚴(yán)重感染的關(guān)鍵機制。腸系膜淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞及腸粘膜固有層樹突狀細(xì)胞為兩組主要的腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞，它們作為抗原遞呈細(xì)胞“指揮”著腸道局部的免疫反應(yīng)。尤其是作為小腸黏膜第一道免疫屏障的LPDCs一直少有人問津，Satoshi Uematsu首次定

3、義CD11chiCD11bhi的固有層細(xì)胞為小腸LPDCs，同時發(fā)現(xiàn)其分別通過獨特的方式實現(xiàn)自身活化、對T、B細(xì)胞分化及淋巴細(xì)胞“回巢”的誘導(dǎo)，這些重要的發(fā)現(xiàn)可能成為創(chuàng)傷/腸粘膜免疫研究新的趨勢。另一方面，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)正常腸內(nèi)即有1012個細(xì)菌和數(shù)倍致死量的內(nèi)毒素。但腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素未能進(jìn)入到循環(huán)中，除了由于機械與免疫屏障的共同防御外，還由于100-1000倍于需氧菌的厭氧菌占據(jù)鄰近上皮細(xì)胞間空隙，最大可能地防止致病菌與腸上皮的直接接觸，從

4、而發(fā)揮了“生物屏障”的作用。但當(dāng)小腸遭遇I/R損傷尤其是臨床治療使用大量光譜抗生素之后，這些正常保護機制被破壞，最終導(dǎo)致腸道發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及腹瀉，同時大量條件性腸道致病菌及其毒素的移位促成全身的嚴(yán)重感染。由此我們推測:嚴(yán)重創(chuàng)傷休克一方面通過缺血再灌注損傷等機制改變腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞的功能進(jìn)而導(dǎo)致腸道免疫防御能力的降低以及全身的免疫狀態(tài)的紊亂;另一方面由于腸道致病菌的大量滋生直接損傷腸粘膜上皮，進(jìn)而加重腸道屏障的損傷。但上述機制的假說

5、尚需確切的證據(jù)。
　　目的：以腸道相關(guān)樹突狀細(xì)胞以及腸上皮作為腸道免疫屏障的關(guān)鍵細(xì)胞，以創(chuàng)傷休克直接影響樹突狀細(xì)胞的功能以及腸道致病菌致腸粘膜上皮損傷作為兩個研究思路，深入研究創(chuàng)傷休克后腸道免疫屏障損傷、細(xì)菌移位發(fā)生及機體遭受嚴(yán)重感染的重要參與機制。
　　方法：⑴以“長骨骨折+失血休克”為基本內(nèi)容，以平均動脈壓30mmHg作為休克標(biāo)準(zhǔn)建立穩(wěn)定的創(chuàng)傷性休克大鼠模型，以腸系膜淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞(MLN-DCs)作為對象，研究其在創(chuàng)

6、傷性休克打擊后的成熟程度、凋亡變化的情況，以及誘導(dǎo)naive CD4+T細(xì)胞向各CD4+T輔助細(xì)胞各亞群（Treg，Th1，Th2）分化能力的改變。⑵在建立創(chuàng)傷性休克小鼠模型及Tlr5-/-小鼠培育的基礎(chǔ)上，以特異性表達(dá)Toll樣受體-5(Tlr5)和特有的非T細(xì)胞依賴免疫激活（視黃醇（RA）介導(dǎo)）信號途徑的腸粘膜下固有層樹突狀細(xì)胞(LPDCs)為關(guān)鍵細(xì)胞，通過對其誘導(dǎo)naiveCD4+T細(xì)胞向Th1及Th17分化、合成分泌視黃醇脫氫酶

7、(RALDH)以及以生物熒光標(biāo)記的檸檬酸桿菌作為標(biāo)記檢測創(chuàng)傷休克后腸道細(xì)菌移位的改變的檢測。⑶在臨床獲得數(shù)株腸源性耐萬古霉素屎腸球菌（VRE），并已證實其具有較強的致腸上皮損傷的特性，分別種植于caco2模型上，采用電鏡觀察、caco2細(xì)胞層電壓檢測以及TNF-α等細(xì)胞因子的檢測等方法以證實臨床驗證的腸道致病菌直接損傷腸上皮面膜屏障的機制。
　　結(jié)果：①大鼠MLN-DCs在創(chuàng)傷性休克發(fā)生后的早期即出現(xiàn)成熟度(CD80，CD86，M

8、HCⅡ)下降、凋亡增加，并且誘導(dǎo)na(i)ve CD4+T細(xì)胞向Th2及Treg細(xì)胞分化的趨勢。②創(chuàng)傷性休克可以導(dǎo)致小腸LPDCs合成RA的能力出現(xiàn)明顯下降，由此使得LPDCs誘導(dǎo)Th1及Th17分化下調(diào)。正常情況下Tlr5-KO小鼠小腸LPDCs合成RA及誘導(dǎo)Th1分化的能力較野生型明顯減弱，但創(chuàng)傷休克發(fā)生后變化不明顯。創(chuàng)傷性休克可以導(dǎo)致野生型小鼠小腸內(nèi)細(xì)菌移位明顯增加，但并未導(dǎo)致Tlr5-KO小鼠腸道細(xì)菌向血液及肝臟的移位明顯增加。