狂犬病病毒M蛋白與細胞傳播性相關(guān)的功能位點分析.pdf

1、狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)具有嚴格的神經(jīng)嗜性，可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)發(fā)生退行性疾病，死亡率居高不下，全球每年因其死亡人數(shù)高達70，000人，是全社會必須關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前只能做好暴露前和暴露后預防才能有效控制狂犬病病毒的傳播，除加強對人的免疫外，同時亦要加強對家養(yǎng)及野生動物的管理。
　　狂犬病病毒基因組擁有5個開放閱讀框(Open Reading Fr

2、ame，ORF)，依次編碼N、P、M、G和L蛋白，其中M蛋白參與病毒的出芽與釋放，同時具有調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄與復制的作用。本研究小組先前選取廣西的街毒株GX01株為研究對象，探索其M基因?qū)Σ《旧飳W特性的影響。GX01株為廣西分離強毒株，腦內(nèi)注射能100％致死成年小鼠。選取日本動物用狂犬病疫苗株RC-HL株的全長感染性cDNA克隆為骨架，RC-HL株為實驗室固定的弱毒株，不致死成年小鼠。將GX01株M基因的44-46位氨基酸區(qū)域替換到rRC-

3、HL的相應位置，證實可明顯地影響病毒在細胞間的傳播特性。為進一步查明導致狂犬病病毒在細胞間傳播性降低的功能性氨基酸，針對M蛋白44和46位氨基酸殘基分別進行F44L、S46G和F44L/S46G突變，運用反向遺傳技術(shù)拯救出3個突變病毒，即rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL(M44/46)株，然后測定其在細胞間的傳播特性。
　　對親本病毒rRC-HL株、重組病毒rRC-HL(GX01M)株、突變病毒rR

4、C-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL(M44/46)株及強毒株GX01株進一步測定其生物學特性。實驗表明，在BSR/T7-9細胞上，重組病毒rRC-HL(GX01 M)株和突變病毒rRC-HL(M44/46)株的病毒滴度顯著低于親本病毒rRC-HL株的病毒滴度，而高于強毒株GX01株。通過空斑試驗表明親本毒株rRC-HL株在BSR/T7-9細胞間的傳播能力最強，rRC-HL(GX01M)株、rRC-HL(M44)

5、株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL(M44/46)株分別比親本病毒rRC-HL株低1.8、1.5、1.3、2.6倍，街毒株GX01株比rRC-HL株低15.6倍，傳播能力最低。這些結(jié)果說明M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變能夠顯著降低病毒在細胞間的傳播能力。各病毒株感染BSR/T7-9細胞48 hpi時，親本毒株rRC-HL株和rRC-HL(M46)株可誘導產(chǎn)生明顯的細胞病變(CPE)，rRC-HL(M44)株可產(chǎn)生輕度的CPE

6、，但是突變株rRC-HL(GX01 M)株、rRC-HL(M44/46)株與GX01株一樣不誘導產(chǎn)生CPE，說明M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變可明顯降低病毒產(chǎn)生CPE。
　　重組病毒rRC-HL(GX01 M)株、rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL(M44/46)株與親本病毒rRC-HL株一樣不致死成年小鼠，只是造成小鼠4-8d體重下降，之后恢復至正常水平，GX01株在第7天全部致死小鼠。說明GX

7、01株的M蛋白不是主要毒力決定因子，M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變亦不能明顯增強致病性。各病毒株以0.1MOI的病毒量感染BSR/T7-9細胞后，rRC-HL(M46)株與rRC-HL株的N和M基因mRNA水平相似，高于其他病毒株，其中突變病毒rRC-HL(M44/46)株的N和M基因mRNA水平下降較明顯，僅次于街毒株GX01株。N和M蛋白水平與mRNA水平保持一致，rRC-HL株與rRC-HL(M46)株的N和M蛋白表達量均較高

8、，rRC-HL(GX01M)株和rRC-HL(M44)株次之，rRC-HL(M44/46)株的N和M蛋白表達量顯著低于rRC-HL株，與先前的rRC-HL(GX01M2)株結(jié)果相似，GX01株的蛋白表達量最低。
　　狂犬病弱毒株rRC-HL株、rRC-HL(GX01 M)株、rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL(M44/46)株均能在RAW264.7細胞及TLR3敲除的RAW264.7細胞（RAW264

9、.7TLR3-/-細胞）上生長，而GX01株在RAW264.7細胞中受到高度的抑制。TLR3敲除后致使各病毒滴度均下降，但在這兩種細胞中的病毒滴度均顯著低于在BSR/T7-9細胞。各病毒株在RAW264.7細胞及RAW264.7TLR3-/-細胞中mRNA和蛋白表達水平與在BSR/T7-9細胞中的趨勢相似。用ELISA方法檢測各病毒株感染細胞后誘導產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素（Ⅰ型IFN）的含量，發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細胞中12hpi時只有rRC-

10、HL(M44/46)株能夠產(chǎn)生較高水平的IFN-α/β;在24hpi時除GX01株外，其他毒株均誘導產(chǎn)生IFN-α/β，然而，rRC-HL(M44/46)株誘導產(chǎn)生的IFN-α/β水平仍是最高的，IFN-α和IFN-β分別達到了2212.17pg/mL和2036.66pg/mL。在RAW264.7TLR3-/-細胞中，感染病毒12hpi時，rRC-HL(GX01M)株、rRC-HL(M44)株和rRC-HL(M44/46)株產(chǎn)生較高水平

11、的IFN-α/β，IFN-α分別達到了532.5、2070.5和2168.6pg/mL;除了GX01株外，各病毒株在24hpi時誘導產(chǎn)生的IFN-α/β水平幾乎一樣。這些結(jié)果表明，GX01株的M基因替換rRC-HL株M基因后能夠誘導高水平IFN-α/β的產(chǎn)生，而M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變是決定M蛋白誘導產(chǎn)生高水平IFN-α/β的主要原因;在正常的RAW264.7細胞與RAW264.7TLR3-/-細胞中均能產(chǎn)生IFN-α/β，說

12、明TLR3的敲除不影響病毒誘導IFN-α/β的產(chǎn)生。
　　在RAW264.7細胞和RAW264.7TLR3-/-細胞中，感染各病毒株后誘導產(chǎn)生的抗病毒蛋白Viperin的量均與IFN-α/β的量呈正相關(guān)，這說明IFN-α/β通過誘導Viperin蛋白的表達，從而使細胞進入抗病毒狀態(tài)。感染各病毒株后IRF3的蛋白水平與IFN-α/β和Viperin的表達量相一致，說明IRF3參與了調(diào)節(jié)IFN-α/β的產(chǎn)生過程。感染狂犬病病毒后，NF