腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中BACE1水解ST6GAL-1調(diào)節(jié)VE-Cadherin的唾液酸化與功能.pdf

1、單核細(xì)胞侵襲血管內(nèi)皮層進(jìn)入人內(nèi)膜最終形成泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化病變形成早期事件之一。該過(guò)程涉及多種糖蛋白參與，但其機(jī)制尚不清楚。本項(xiàng)目以血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，以α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1（ST6GAL1）是否通過(guò)催化 VE-Cadherin唾液酸化發(fā)揮其在細(xì)胞間緊密連接的作用，而B(niǎo)ACE1蛋白降解途徑對(duì)ST6Gal-1可能起調(diào)控作用為研究核心，探討細(xì)胞粘聯(lián)的分子機(jī)制，尋找炎癥誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的分子基礎(chǔ)。通過(guò)建立 BACE1基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染

2、模型，采用western blot、SNA/MAA blot、免疫共沉淀技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡等技術(shù),檢測(cè) TNF-α誘導(dǎo)前后細(xì)胞中唾液酸化和粘附功能的差異，及對(duì)PKC信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的影響。以期回答糖基轉(zhuǎn)移酶是如何影響動(dòng)脈硬化形成這一科學(xué)問(wèn)題，為相關(guān)疾病的防治提供新的思路。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：炎癥損傷模型的建立。
　　目的：以內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926及RAEC細(xì)胞為研究對(duì)象，建立炎癥損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型

3、，采用分子生物學(xué)的技術(shù)手段，分析不同內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥因子的作用下內(nèi)皮細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)和單核-內(nèi)皮粘附功能的變化，為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒌於ɑA(chǔ)。
　　方法：⑴采用免疫熒光的方法，驗(yàn)證EA.hy926細(xì)胞和RAEC細(xì)胞是否具有內(nèi)皮細(xì)胞特性。⑵采用CCK8法，驗(yàn)證TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響。⑶采用倒置顯微鏡，觀察TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。⑷采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證TNF-α對(duì)單核-內(nèi)皮粘附功能的影響。⑸采用透射電鏡，觀察TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞超

4、顯微結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：①形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，EA.hy926細(xì)胞和RAEC細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性。②CCK8實(shí)驗(yàn)及倒置顯微鏡結(jié)果顯示，TNF-α濃度在0-50ng/ml時(shí)，時(shí)間在0-24h時(shí)，不會(huì)顯著地抑制EA.hy926細(xì)胞存活率。TNF-α濃度在0-20ng/ml時(shí)，時(shí)間在0-24h時(shí)，不會(huì)顯著地抑制RAEC細(xì)胞存活率。③粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TNF-α在0-50ng/ml范圍內(nèi)，能誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的粘附

5、能力顯著上升；TNF-α在0-20ng/ml范圍內(nèi)，能誘導(dǎo)RAEC細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的粘附能力顯著上升。④電鏡結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TNF-α能破壞EA.hy926細(xì)胞的緊密連接。
　　結(jié)論：⑴EA.hy926細(xì)胞和RAEC細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性。⑵炎癥因子刺激下，單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能上調(diào)。⑶炎癥因子刺激后，影響內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接。
　　第二部分：TNF-α通過(guò)上調(diào)BACE1表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中VE-Cadheri

6、n唾液酸下調(diào)，從而破壞內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接及上調(diào)單核-內(nèi)皮的粘附能力。
　　目的：探討在炎癥條件下 BACE1的上調(diào)是否通過(guò)降解 ST6GAL1影響VE-Cadherin唾液酸化修飾。分析BACE1水解 ST6GAL1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和單核-內(nèi)皮粘附功能的影響。
　　方法：⑴采用流式細(xì)胞術(shù)，驗(yàn)證TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞唾液酸化的影響。⑵采用western blot和激光共聚焦顯微鏡，驗(yàn)證炎癥時(shí) BACE1水解ST6GAL1下調(diào)內(nèi)

7、皮細(xì)胞的唾液酸化。⑶采用免疫共沉淀技術(shù)，驗(yàn)證VE-cadherin時(shí)炎癥誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞唾液酸化下調(diào)的靶蛋白。⑷采用BACE1抑制劑（β-secretase inhibitor IV），驗(yàn)證BACE1抑制劑對(duì)炎癥條件下BACE1水解ST6GAL1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞唾液酸化的影響及對(duì)單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能和內(nèi)皮細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響。⑸構(gòu)建BACE1過(guò)表達(dá)模型，驗(yàn)證BACE1水解ST6GAL1調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞唾液酸化的相關(guān)機(jī)制，并檢測(cè)其對(duì)單核-內(nèi)皮粘附功能

8、和內(nèi)皮細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：①TNF-α刺激24h后，與對(duì)照組相比，F(xiàn)ITC-SNA標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度值顯著下調(diào)，說(shuō)明TNF-α誘導(dǎo)了EA.hy926和RAEC細(xì)胞的α2,6-唾液酸水平下調(diào)。而FITC-MAL標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度值未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化，說(shuō)明TNF-α不能顯著改變RAEC細(xì)胞的α2,3-唾液酸水平。②Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α誘導(dǎo)BACE1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)ST6GAL

9、1及總蛋白α2,6-唾液酸水平的表達(dá)水平下調(diào)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，正常的內(nèi)皮細(xì)胞的表面存在α2,6-唾液酸修飾，而TNF-α誘導(dǎo)后，內(nèi)皮細(xì)胞的α2,6-唾液酸修飾水平降低。③IP實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，TNF-α誘導(dǎo)后 VE-Cadherin的唾液酸化水平顯著降低。④Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，BACE1抑制劑能拮抗TNF-α誘導(dǎo)的BACE1上調(diào)及BACE1降解ST6GAL1及下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的唾液酸化。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，BA

10、CE1抑制劑能拮抗TNF-α誘導(dǎo)的單核-內(nèi)皮粘附能力的升高。透射電鏡結(jié)果顯示，BACE1抑制劑能拮抗 TNF-α破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接。⑤過(guò)表達(dá)BACE1基因后，Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，ST6GAL1和內(nèi)皮細(xì)胞唾液酸化的表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)BACE1基因后，單核-內(nèi)皮的粘附能力升高。透射電鏡結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BACE1破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接。
　　結(jié)論：⑴TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞唾液酸水平的下

11、調(diào)。⑵TNF-α誘導(dǎo)BACE1降解 ST6GAL1下調(diào)VE-Cadherin的唾液酸化，從而提高單核-內(nèi)皮細(xì)胞的粘附功能及破壞內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接。⑶BACE1抑制劑通過(guò)拮抗BACE1水解ST6GAL1的相關(guān)機(jī)制，從而影響單核-內(nèi)皮的粘附能力及內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接。⑷BACE1基因過(guò)表達(dá)后，BACE1水解 ST6GAL1，通過(guò)下調(diào)靶蛋白VE-Cadherin的唾液酸化降低了內(nèi)皮細(xì)胞的唾液酸化，從而影響單核-內(nèi)皮的粘附能力及內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接

12、。
　　第三部分：TNF-α上調(diào)BACE1表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。
　　目的：探討TNF-α通過(guò)PKC/MEK/ERK信號(hào)通路上調(diào)BACE1的表達(dá)。
　　方法：⑴采用western blot，驗(yàn)證TNF-α通過(guò)激活PKC的磷酸化上調(diào)BACE1的表達(dá)。⑵采用western blot，驗(yàn)證PKC/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)之間的關(guān)系，并驗(yàn)證TNF-α通過(guò)激活PKC/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)上調(diào)BACE1的表達(dá)。⑶采用粘附實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)

13、證炎癥條件下 PKC信號(hào)通路對(duì)單核-內(nèi)皮粘附功能的影響。
　　結(jié)果：①與對(duì)照組相比，PKC的磷酸化水平顯著升高。②與對(duì)照組相比，PKC的激活劑上調(diào)了BACE1的表達(dá)(P<0.05)，PKC的抑制劑拮抗了BACE1的上調(diào)(P<0.05)。③與TNF-α組相比，PKC抑制劑組的MEK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，ERK抑制劑組的MEK磷酸化水平?jīng)]有顯著的變化(P＞0.05)（。圖3.3A、B）與TNF-α組相比，PKC抑制劑組的

14、ERK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，ERK抑制劑組的ERK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。（圖3.3C、D）與TNF-α相比，PKC的抑制劑或ERK的抑制處理后，BACE1的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。這一結(jié)果表明 TNF-α通過(guò)激活PKC/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)上調(diào)BACE1的表達(dá)。④與 TNF-α組相比，PMA處理后單核-內(nèi)皮的粘附能力顯著升高(P＜0.05)。PKC的抑制劑處理后單核-內(nèi)皮的粘附能力顯著降低(P