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1、雞的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)有三種:IgY、IgM和IgA。IgY與哺乳動(dòng)物IgG的抗病功能相同,但結(jié)構(gòu)上存在差異,IgY重鏈上沒(méi)有鉸鏈結(jié)構(gòu)。IgY由兩條重鏈(HeavyChain,H)和兩條輕鏈(LightChain,L)構(gòu)成。各有一個(gè)可變區(qū)(VariableRegion,V)位于H和L的N端,稱(chēng)為VH和VL。與抗原表位(Epitope)特異結(jié)合的區(qū)域就位于V上,由VH和VL的三個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(Complem
2、entarity-determiningregions,CDR)共同形成。研究表明,編碼IgYVL的基因是Vλ-Jλ。雞IgYL的多樣性是在雞法氏囊發(fā)育期間依靠基因轉(zhuǎn)換(Geneconversion)形成。以后在抗原刺激下發(fā)生體細(xì)胞多樣化(SomaticDiversiflcation)而獲得高親和力(Affinity)。 雞與哺乳動(dòng)物進(jìn)化距離大。因此雞對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的抗原物質(zhì)容易產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答,產(chǎn)生出針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗原的高親和
3、力IgY。雞血清中的IgY先轉(zhuǎn)移到蛋黃中儲(chǔ)存,胚胎發(fā)育時(shí)又從蛋黃中進(jìn)入雞胚血液。利用多次免疫接種技術(shù)可以獲得高效價(jià)特異IgY的高免雞蛋,可以采用生化技術(shù)從中制備大量的純IgY。許多研究證明,雞IgY特異性高,親和力可與鼠源單抗媲美,穩(wěn)定性好(在70℃以下和pH4以上活性穩(wěn)定)。高免雞蛋生產(chǎn)簡(jiǎn)便,批量大,無(wú)須采血,符合動(dòng)物福利。因此,利用蛋雞大量生產(chǎn)特異IgY的技術(shù)(IgYTechnology)倍受重視,已有產(chǎn)品上市。 雞IgY技
4、術(shù)存在不足之處。(1)雞病太多,尤其禽流感等人禽共患病給雞IgY產(chǎn)品安全性帶來(lái)了影響,專(zhuān)家們呼吁要用SPF雞生產(chǎn)IgY。不難想象,其成本很高,在動(dòng)物藥品市場(chǎng)上缺乏競(jìng)爭(zhēng)力。(2)抗原量大(多次免疫),有些抗原對(duì)雞群健康有危害。(3)雞IgY具有強(qiáng)抗原性,在哺乳動(dòng)物上應(yīng)用時(shí)受抗抗體和血清病影響,難以發(fā)揮作用。 McCafferty(1990)首次報(bào)道出利用PDT構(gòu)建抗體基因文庫(kù)。由于抗體蛋白表達(dá)于噬菌體的表面,采用抗原抗體特異結(jié)合的
5、親和淘洗技術(shù)可以獲得抗體基因的重組噬菌體克隆。從這些克隆中提取抗體基因可以在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)。重組噬菌體技術(shù)能有效的模仿免疫多樣性和選擇性的特征,能很容易的通過(guò)測(cè)序、突變和篩選來(lái)提高重組噬菌體抗體對(duì)抗原的結(jié)合力,無(wú)限量的合成和表達(dá)實(shí)際上可針對(duì)任何抗原的抗體分子。因此,本研究的目的就是利用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建一個(gè)雞單鏈抗體基因文庫(kù),這為快速研制新抗體奠定基礎(chǔ)。 研究方法:(1)根據(jù)Genbank報(bào)道的雞IgYVλ框
6、架區(qū)(Framework,F(xiàn)R)FR1和FR4設(shè)計(jì)VH、VL的上下游引物,并引入克隆位點(diǎn);設(shè)計(jì)親水性的(Gly4Ser)3多肽DNA接頭(Linker);(2)從8周齡雞脾臟中提取總RNA,以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,作為模版,在VH、VL上下游引物作用下PCR擴(kuò)增獲得VH和VL基因,利用重疊(Overlap)PCR將VH和VL通過(guò)人工合成的Linker連接成VH-Linker-VL,即ScFv基因;(3)通過(guò)SacI
7、和NotⅠ酶切重組入T7select10-3b中,經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)染E.coliBLT5403株即獲得雞ScFv基因T7PDT文庫(kù);(4)通過(guò)噬菌斑計(jì)數(shù)庫(kù)容量,任取6個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定,純化PCR產(chǎn)物,測(cè)序,并與Genbank中雞IgY基因序列比對(duì)。(5)選擇4種抗原進(jìn)行生物淘洗;(6)AIV和GPV兩種抗原生物淘洗陽(yáng)性克隆噬菌體液進(jìn)行ELISA競(jìng)爭(zhēng)阻斷試驗(yàn);(7)抗GPVScVL亞克隆到表達(dá)載體pET28b(+)中,轉(zhuǎn)染Tuner進(jìn)
8、行誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)蛋白,采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗體活性。 研究結(jié)果:(1)意外獲得雞IgY輕鏈可變區(qū)基因PDT文庫(kù),命名為雞IgY單輕鏈抗體可變區(qū)(Singlechainoflightvariableregion,ScVL)基因T7PDT文庫(kù)。測(cè)得庫(kù)容為4.5×106pfu,ScVL片段大小為450bp;(2)ScVL序列包含有雞IgYVL基因、Linker序列、未知序列(27bp)及重鏈可變區(qū)上游H5引物序列。(3
9、)AIV和GPV抗原生物淘洗均獲陽(yáng)性克隆ScVL/AIV和ScVL/GPV,四輪淘洗后噬菌斑回收率分別增加了1639和61倍。(4)ScVL/AIV和ScVL/GPV噬菌體培養(yǎng)液ELISA競(jìng)爭(zhēng)阻斷試驗(yàn)的抑制率分別為17.6﹪和14.6﹪。(5)ScVL/GPV克隆在E.coliTuner中表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白質(zhì),分子量為23kD,競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抑制率達(dá)到28﹪,說(shuō)明GPVScVL具有抗體親和性。 結(jié)論:構(gòu)建起了雞IgYScV
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