DNA損傷應(yīng)答中p38α的作用機(jī)制及乳腺癌干細(xì)胞與Tregs的相互作用研究.pdf

1、第一部分
　　背景：化療和放療可以引起快速增殖的腫瘤細(xì)胞發(fā)生 DNA損傷，DNA損傷可以通過激活 p53信號通路來激發(fā)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞凋亡。激活的 p53信號通路通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控p21WAF1的表達(dá)來引起可逆的細(xì)胞周期停滯，這樣為DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞再次利用完整的 DNA進(jìn)入細(xì)胞周期提供了時間[1,2]。如果不能修復(fù)損傷的DNA，細(xì)胞會發(fā)生凋亡，而這一過程也是由p53信號通路調(diào)控的。通過翻譯后修飾，p53通過誘導(dǎo)PUMA的表達(dá)來促進(jìn)

2、細(xì)胞凋亡[3,4]。
　　p53通過調(diào)控不同的目的基因的表達(dá)來決定細(xì)胞的命運(yùn)，而p53的轉(zhuǎn)錄活性是由不同的翻譯后修飾來決定的[5]。細(xì)胞發(fā)生 DNA損傷后，p53既可以被磷酸化，也可以被乙酰化[6-8]。p53可以被組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP/p300乙?；銴320[7,9]、K164[10]或C端結(jié)構(gòu)域的K370、372、373和K382[8]等位點(diǎn)，這樣可以阻斷Mdm2和Mdmx與p53的結(jié)合，從而抑制p53的降解并促進(jìn)p53與

3、其目的基因的啟動子結(jié)合。另外，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶hMOF和Tip60可以乙?；痯53的K120位點(diǎn)，并激活其促凋亡活性而非其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯的活性[11]。
　　Tip60是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）MYST家族的成員，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[12,13]。Tip60作為共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與目的基因的啟動子結(jié)合，通過乙?；M蛋白來促進(jìn)目的基因的表達(dá)。另外，Tip60可以通過直接相互作用并乙?；揎椃墙M蛋白來調(diào)節(jié)其活性或表達(dá)水平[11-

4、13]。有研究表明，Tip60參與細(xì)胞的凋亡[14,15]、DNA損傷的應(yīng)答[16]以及原癌基因誘導(dǎo)的衰老[17]，同時，Tip60還是一個潛在的抑癌基因[18]。
　　DNA損傷發(fā)生后，Tip60可以通過乙酰化p53的K120位點(diǎn)，并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡；在Ras原癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中，p38磷酸化Tip60的T158位點(diǎn)，并激活 Tip60的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。因此，我們的研究旨在明確是否 p38介導(dǎo)的Tip60磷酸化可以使Tip6

5、0在DNA損傷誘導(dǎo)凋亡等其他生物學(xué)功能中起作用。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)DNA發(fā)生損傷后，可以導(dǎo)致p38磷酸化并激活其激酶活性，磷酸化 Tip60的 T158位點(diǎn)，從而導(dǎo)致 p53K120乙?；?；而且 p38α和 Tip60對p53K120的乙酰化、p53與PUMA啟動子的結(jié)合、PUMA表達(dá)的誘導(dǎo)以及細(xì)胞的凋亡都是必要的，當(dāng)通過RNAi下調(diào)p38α和Tip60的表達(dá)或通過小分子抑制劑抑制p38α的活性都會使p53-K120位點(diǎn)的乙?；?/p>

6、程度、p53與PUMA啟動子的結(jié)合效率、PUMA的表達(dá)水平以及凋亡細(xì)胞的比例降低；另外，通過直接過表達(dá)持續(xù)激活的p38α上游基因MKK3和MKK6就可以導(dǎo)致Tip60T158的磷酸化水平、p53K120的乙?；揭约癙UMA的表達(dá)水平增加，從而引起細(xì)胞凋亡；但是把Tip60的T158位點(diǎn)突變?yōu)锳158后，Tip60不能被p38α磷酸化，從而不能引起其下游p53K120的乙?；?、不能誘導(dǎo)PUMA表達(dá)和細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：DNA損

7、傷應(yīng)答的過程中，p38在激活 Tip60的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性中起了重要作用，并且對 Tip60下游通路 p53/PUMA的誘導(dǎo)表達(dá)及其引起的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要；同時提示了p38和Tip60抑制腫瘤的機(jī)制。
　　第二部分
　　背景：近期研究表明，在乳腺癌中有腫瘤干細(xì)胞存在[1-3]，而且最腫瘤的復(fù)發(fā)[4]、轉(zhuǎn)移以及耐藥[5]等過程都起到重要作用。像正常腫瘤細(xì)胞一樣，腫瘤干細(xì)胞干性的維持也需要與腫瘤微環(huán)境的相互作用[6]。
　　

8、腫瘤微環(huán)境主要由包括糖蛋白、透明質(zhì)酸和纖維狀蛋白（例如：膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白）等組成的細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞組成。基質(zhì)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等間葉狀細(xì)胞、血管系統(tǒng)相關(guān)的細(xì)胞以及免疫細(xì)胞[7]。很多研究表明腫瘤微環(huán)境可以增加干細(xì)胞的干性，而且同時，腫瘤干細(xì)胞也可以修飾腫瘤微環(huán)境。例如，在多種腫瘤中成纖維細(xì)胞可以調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的平衡[8,9]。作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在乳腺癌中 CD4+CD25+ Tregs可以抑制腫瘤的免疫

9、應(yīng)答[10,11]、促進(jìn)血管新生[12]以及轉(zhuǎn)移[13,14]。但是，在乳腺癌中Tregs對腫瘤細(xì)胞干性的調(diào)節(jié)目前研究較少。
　　腫瘤組織可以通過多種細(xì)胞因子的表達(dá)招募 CD4+CD25+Tregs進(jìn)入腫瘤微環(huán)境[10]。目前研究表明，霍奇金氏淋巴瘤可以通過分泌CCL22招募Tregs[15]，而且卵巢癌細(xì)胞可以通過分泌CCL28招募Tregs進(jìn)入腫瘤微環(huán)境[16]。另外，胰腺癌細(xì)胞可以通過CCL5招募Tregs[17]。但是，關(guān)

10、于乳腺癌干細(xì)胞對Tregs招募的具體機(jī)制尚不清楚。
　　結(jié)果：我們探討了Tregs可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的干性，并且腫瘤干細(xì)胞可以招募Tregs進(jìn)入腫瘤微環(huán)境。我們發(fā)現(xiàn)使用Tregs上清液處理細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞比例、ALDHbr細(xì)胞比例、細(xì)胞成球數(shù)量增加，而且可以增加乳腺癌細(xì)胞的耐藥以及干性相關(guān)基因 Sox2、Nanog、Klf4、Oct4的表達(dá)。同時，在小鼠腫瘤模型中證實(shí)，Tregs可以促進(jìn)腫瘤的成瘤以及轉(zhuǎn)移能力。另外，我們

11、證實(shí)，過表達(dá)腫瘤干細(xì)胞重要的維持基因Sox2后，細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路促進(jìn)CCL1的表達(dá)，從而增加了Tregs的招募。另外，我們通過對乳腺癌病人的組織切片染色發(fā)現(xiàn)，SOX2的表達(dá)程度與腫瘤組織中Tregs的浸潤程度成正相關(guān)。
　　結(jié)論：Tregs細(xì)胞可以增加乳腺癌細(xì)胞的干性，同時，乳腺癌干細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路促進(jìn)CCL1的表達(dá)，從而增加Tregs的招募。SOX2的表達(dá)程度與腫瘤組織中Tregs的浸潤程度成