金黃色葡萄球菌α-溶血素抑制B細(xì)胞受體信號(hào)通路活化機(jī)制的初步研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，簡(jiǎn)稱金葡菌，是一種自然界中廣泛存在的革蘭陽(yáng)性致病菌，能夠引起心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和腦膜炎等多種疾病。α-溶血素(alpha hemolysin，Hla)是金葡菌致病的關(guān)鍵毒力因子之一，其相對(duì)分子質(zhì)量為33000。作為穿孔毒素(pore forming toxin，PFT)家族成員之一，Hla蛋白在宿主細(xì)胞的膜表面形成七聚體的功能形式，穿透細(xì)胞膜繼而導(dǎo)致細(xì)胞裂解。然而很多研究

2、表明，Hla蛋白亦具有非PFT作用，如通過(guò)影響免疫細(xì)胞進(jìn)而影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，但是具體機(jī)制尚不清楚。進(jìn)一步的研究則表明Hla蛋白與細(xì)胞膜表面的ADAM10蛋白結(jié)合促進(jìn)七聚體的形成，同時(shí)Hla蛋白通過(guò)與ADAM10蛋白相互作用抑制A549細(xì)胞中Src激酶的磷酸化水平。
　　蛋白激酶Src參與細(xì)胞分化、遷移、增殖、存活等多個(gè)過(guò)程，不僅可影響下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，也參與了B細(xì)胞受體(B cell receptor, BCR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。B

3、CR介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)B細(xì)胞發(fā)育、抗體產(chǎn)生等過(guò)程至關(guān)重要。
　　本研究的第一部分為金黃色葡萄球菌α-溶血素及其突變體蛋白的表達(dá)純化及中和性抗體的制備。具體內(nèi)容有:
　　1.Hla蛋白的表達(dá)純化及活性驗(yàn)證。通過(guò)構(gòu)建Hla蛋白的表達(dá)載體，利用原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌重組表達(dá)Hla蛋白。通過(guò)紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)測(cè)定Hla蛋白的溶血活性，驗(yàn)證其對(duì)不同種屬紅細(xì)胞的裂解作用的差異。
　　2.Hla蛋白的突變體蛋白HlaH35L的表達(dá)純化及活性

4、驗(yàn)證。通過(guò)重疊PCR方法將Hla蛋白除信號(hào)肽之外的第35個(gè)氨基酸組氨酸(H)替換為亮氨酸(L)，并測(cè)定突變體蛋白的溶血活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，其不能夠裂解兔紅細(xì)胞。
　　3.Hla蛋白中和性抗體的制備。制備并純化Hla蛋白的特異性多克隆抗體，溶血活性檢測(cè)結(jié)果顯示Hla蛋白的多克隆抗體能夠抑制Hla蛋白介導(dǎo)的兔紅細(xì)胞裂解作用，表明該抗體具有良好的中和活性。
　　本文的第二部分為Hla蛋白抑制BCR信號(hào)通路機(jī)制的初步研究。

5、具體內(nèi)容如下:
　　1.Hla蛋白可與小鼠B細(xì)胞系WEHI-231特異性結(jié)合。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hla蛋白可與WEHI-231細(xì)胞特異性結(jié)合。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)則證實(shí)該結(jié)合部分依賴于Hla蛋白受體ADAM10。同時(shí)證實(shí)突變體蛋白HlaH35L與Hla蛋白具有一致的結(jié)合活性。
　　2.Hla蛋白抑制BCR信號(hào)通路機(jī)制的初步研究。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hla蛋白可以抑制anti-IgM所誘導(dǎo)的WEHI-231細(xì)胞凋亡。W

6、estern Blotting結(jié)果則表明，與A549細(xì)胞不同，Hla蛋白及突變體蛋白都能夠誘導(dǎo)WEHI-231細(xì)胞Src的磷酸化，BCR通路活化則導(dǎo)致Src磷酸化程度降低，Hla蛋白可通過(guò)誘導(dǎo)Src的磷酸化繼而影響B(tài)CR信號(hào)通路。綜上所述，我們成功獲得了純度較高的金葡菌重組Hla蛋白及其突變體HlaH35L蛋白，制備并純化了具有良好中和活性的Hla蛋白的特異性多克隆抗體。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)，Hla蛋白及突變體蛋白都能夠通過(guò)結(jié)合ADAM10誘